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2019年7月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布了關(guān)于抗病毒藥物產(chǎn)品提交二代測(cè)序數(shù)據(jù)的指南。指南為抗病毒藥物產(chǎn)品向FDA提交二代核苷酸序列分析程序以及支持耐藥性評(píng)估數(shù)據(jù)提供了意見。

一、背景信息   

為保護(hù)公共衛(wèi)生、避免出現(xiàn)可能傳染他人并導(dǎo)致不能通過已批準(zhǔn)藥物產(chǎn)品控制疾病暴發(fā)的新型耐藥和交叉耐藥病毒變異體，提供準(zhǔn)確的耐藥性信息勢(shì)在必行。

FDA對(duì)開發(fā)中的抗病毒藥物產(chǎn)品相關(guān)的耐藥性數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立分析，從而確保在新審批的抗病毒藥物產(chǎn)品說明書中對(duì)產(chǎn)品耐藥性進(jìn)行表征分析和解釋。此外，F(xiàn)DA要求將宿主靶向基因的核苷酸序列分析數(shù)據(jù)用于多態(tài)性分析，以此確定基于不同種群的等位基因是否對(duì)療效有影響。

二、二代數(shù)據(jù)提交要求

FDA要求申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)提交詳細(xì)的方案來(lái)描述樣本處理和二代測(cè)序技術(shù)（NGS）分析程序。同時(shí)每個(gè)研究的數(shù)據(jù)應(yīng)提供基于種群測(cè)序、適合分析的病毒耐藥性數(shù)據(jù)格式，顯示基線和無(wú)效序列，并在氨基酸與參考序列相同時(shí)使用空白細(xì)胞。FDA建議申請(qǐng)人在與FDA協(xié)商后，建立耐藥性數(shù)據(jù)集的靈敏度水平，或者提供選擇靈敏度水平的理由。提供顯示每個(gè)研究或研究亞組（例如各基因型、各劑量）的主要替換的高水平匯總的表格。

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)提供：（1）頻率表來(lái)報(bào)告所有頻率大于或等于1%的與基線不同的氨基酸替換。（2）以fastq格式提供每次序列運(yùn)行中的所有原始NGS數(shù)據(jù)，拼接的序列比對(duì)可以選擇以“.fas”“.ace”“ .sam”或“.bam”格式提交。（3）適當(dāng)?shù)膮⒖夹蛄幸约坝糜谌魏螀⒖急葘?duì)的信息。（4）基線或參考共有序列并陳述該序列是如何得出的。（5）對(duì)于從頭拼接，以fastq格式提供所有大于200個(gè)核苷酸的重疊群。

三、NGS檢測(cè)要求

NGS方案中包含以下通用方案設(shè)計(jì)元素：（1）受試者、研究時(shí)間點(diǎn)和待分析的樣本矩陣的描述；（2）待使用的NGS平臺(tái)的描述，包括所有相關(guān)的性能特征；（3）待分析的目標(biāo)基因區(qū)域名稱和大��；（4）通用分析策略（例如：鑒別相對(duì)于原型株的改變，比較同一受試者不同時(shí)間點(diǎn)的序列）；（5）檢測(cè)的覆蓋水平，對(duì)于一些病毒載量較低的樣本可能不能在滿足要求的覆蓋水平下產(chǎn)生拼接，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)鑒別不能達(dá)到該覆蓋水平的樣本；（6）用于鑒別、過濾或處理測(cè)序錯(cuò)誤的方法描述。

獲得可靠測(cè)序結(jié)果的關(guān)鍵是模板制備，因此待測(cè)序的樣本代表了正在分析的種群，應(yīng)對(duì)以下信息進(jìn)行描述：從樣本中提取核酸的方法；從污染背景核酸中純化病毒序列的方法；濃縮病毒核酸的方法，包括每個(gè)樣本用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）（病毒RNA）或PCR（病毒DNA）反應(yīng)的估算目標(biāo)拷貝數(shù)；變性次級(jí)結(jié)構(gòu)的方法；生成雙鏈DNA（dsDNA）的方法（包括引物的描述、純化dsDNA用于測(cè)序的方法）；NGS文庫(kù)制備的方法等。

四、NGS數(shù)據(jù)分析方法和報(bào)告要求

序列數(shù)據(jù)的提交必須包括對(duì)用于分析測(cè)序數(shù)據(jù)集和原始序列信息分析流程的全面描述，這樣FDA才能進(jìn)行獨(dú)立的數(shù)據(jù)分析。報(bào)告應(yīng)當(dāng)包括（1）每個(gè)序列運(yùn)行測(cè)序的序列總數(shù)，測(cè)序序列的質(zhì)量評(píng)分，測(cè)序序列的平均長(zhǎng)度，為降低平臺(tái)特異性誤差影響而進(jìn)行的任何誤差評(píng)估的描述，以及有關(guān)采用了何種修飾參數(shù)來(lái)清除潛在序列誤差或者去除未能滿足任何質(zhì)量或長(zhǎng)度閾值的測(cè)序序列的信息。（2）用于向關(guān)注序列中添加條形碼序列的方法描述，用于根據(jù)條形碼將測(cè)序序列分類的程序，條形碼序列是如何從序列修飾的描述，以及所采取的任何消除潛在交叉條形碼污染的預(yù)防措施的描述。

NGS數(shù)據(jù)分析可采用兩種方法來(lái)支持抗病毒藥物產(chǎn)品的開發(fā)：（1）短測(cè)序序列與參考序列比對(duì)。（2）短測(cè)序序列從頭拼接來(lái)組裝重疊群。比對(duì)測(cè)序序列與參考序列并識(shí)別變異體。根據(jù)序列比對(duì)和變異體識(shí)別報(bào)告結(jié)果。

五、NGS文件類型和提交程序

Fastq格式的原始NGS數(shù)據(jù)和頻率表應(yīng)當(dāng)按照技術(shù)規(guī)范文檔《采用eCTD傳遞電子申請(qǐng)規(guī)格》中列出的指南，通過安全便攜式硬盤發(fā)送至FDA。便攜式硬盤的內(nèi)容應(yīng)注意：（1）硬盤僅可提交原始NGS數(shù)據(jù)、頻率表和目錄；（2）所有NGS數(shù)據(jù)均應(yīng)當(dāng)以fastq格式提供，其中包括核苷酸序列和質(zhì)量信息；（3）各個(gè)時(shí)間點(diǎn)每例受試者的NGS序列運(yùn)行，包括基線和接近觀察到治療失敗的時(shí)間點(diǎn)；（5）申請(qǐng)人提供的fastq文件應(yīng)當(dāng)標(biāo)記有唯一的受試者識(shí)別碼和時(shí)間點(diǎn)；（6）NGS方案、適合分析的耐藥性數(shù)據(jù)集以及任何其他支持信息均應(yīng)當(dāng)通過CDER電子文件途徑提交。

六、結(jié)語(yǔ)

NGS是一種新興技術(shù)，申請(qǐng)人在進(jìn)行基于序列的耐藥性分析時(shí)頻繁采用該項(xiàng)技術(shù)。由于該技術(shù)可生成臨床樣本中所有RNA或DNA的核苷酸序列，故NGS檢測(cè)在有效區(qū)分病原體變異體的同時(shí)，也增加了耐藥性分析過程的復(fù)雜性。與Sanger核苷酸序列分析相比， NGS可提供一個(gè)病毒種群中個(gè)體病毒的核苷酸序列信息，通常每個(gè)樣本能提供數(shù)以百萬(wàn)計(jì)或數(shù)以億計(jì)的短序列。由于目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息分析方法來(lái)分析這些大型數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)的復(fù)雜性為審評(píng)員分析和驗(yàn)證序列信息帶來(lái)了挑戰(zhàn)。目前，器審中心尚未收到該類產(chǎn)品的注冊(cè)申報(bào)，F(xiàn)DA關(guān)于抗病毒藥物產(chǎn)品提交二代測(cè)序數(shù)據(jù)的要求為器審中心將來(lái)對(duì)同類檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行技術(shù)審評(píng)起到借鑒作用。