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循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的DNA片段，是循環(huán)游離DNA（circulatingcell-free DNA，cfDNA）的一部分。健康人群中大部分cfDNA的長(zhǎng)度在70~200 bp，但腫瘤患者的ctDNA長(zhǎng)度可能為200 bp甚至超過1000 bp。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增、微衛(wèi)星改變、表觀遺傳修飾等。當(dāng)腫瘤DNA進(jìn)入血液時(shí)，這些基因缺陷模式在血漿和血清中也可被檢測(cè)到。

甲基化是DNA的一種重要修飾，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程。哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在CpG雙核苷酸的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。人基因組中60%~90%的（CpG）都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，主要位于基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域，長(zhǎng)度為300~3 000 bp�？拷�或位于啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化一般會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄，沉默相關(guān)基因的表達(dá)。在腫瘤中，抑癌基因和DNA修復(fù)基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常高甲基化使得抑癌基因沉默和修復(fù)基因失活，從而喪失對(duì)腫瘤發(fā)生的抑制作用，也是目前腫瘤甲基化研究的主要方向。與其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作為最早發(fā)現(xiàn)的表觀修飾途徑之一，其異常甲基化模式在不同腫瘤組織中具有高度特異性。特征性的甲基化"指紋"圖譜可用于癌癥早期診斷與分期、療效評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等。

ctDNA甲基化檢測(cè)在癌癥診療應(yīng)用中，基于血液標(biāo)本一定程度上可以克服實(shí)體瘤組織標(biāo)本的局限性，例如：（1）ctDNA在血液中半衰期短，可以實(shí)時(shí)反映腫瘤的動(dòng)態(tài)變化；（2）可以克服腫瘤組織取樣的異質(zhì)性；（3）重復(fù)活檢可以追蹤腫瘤的克隆演變；（4）可以識(shí)別轉(zhuǎn)移性腫瘤。因此，在過去的30年中，DNA甲基化被認(rèn)為是有希望檢測(cè)癌癥的生物標(biāo)志物[1]。

一、ctDNA甲基化檢測(cè)技術(shù)方法及研究思路

1．常用檢測(cè)方法及技術(shù)難點(diǎn)：

目前，ctDNA甲基化標(biāo)志物的研究思路已經(jīng)比較明確。首先，通過芯片或二代測(cè)序?qū)δ[瘤組織和正常組織進(jìn)行全基因組范圍的甲基化信號(hào)掃描，尋找腫瘤特異的甲基化標(biāo)志物位點(diǎn)；然后再針對(duì)這些位點(diǎn)對(duì)ctDNA進(jìn)行性價(jià)比更高的靶向測(cè)序，驗(yàn)證標(biāo)志物性能。雖然研究思路比較清晰，但甲基化檢測(cè)技術(shù)的諸多局限也一直困擾著研究人員。一方面，血液ctDNA含量很低，某些特定類型的腫瘤或中晚期腫瘤有可能達(dá)到20 ng/ml。技術(shù)上最大的挑戰(zhàn)是需要從含有不同數(shù)量cfDNA的血液樣品中鑒定極少量的ctDNA。另一方面，目前甲基化檢測(cè)技術(shù)基本上均基于亞硫酸氫鹽（bisulfite，BS）使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不變。目前基于BS的甲基化檢測(cè)技術(shù)主要包括PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及基于雜交的捕獲技術(shù)[2]，其中擴(kuò)增的應(yīng)用較廣泛。BS處理后未甲基化的C變U，PCR擴(kuò)增后U配對(duì)T，因此擴(kuò)增后DNA變?yōu)楦缓珹和T（AT-rich），與原本具有甲基化修飾的C堿基區(qū)分開來。但是，研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增過程中甲基化狀態(tài)的DNA（GC含量高）易產(chǎn)生擴(kuò)增偏好，在文庫中富集。所以，需要在高效捕獲BS DNA片段的同時(shí)，還要保證甲基化信號(hào)在擴(kuò)增過程中均勻放大，不走樣。

2．近年來研究思路的突破方向：

過去研究多聚焦于單基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，研究發(fā)現(xiàn)多基因組合檢測(cè)可以進(jìn)一步提高DNA甲基化特征的特異性和敏感性。隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，甲基化檢測(cè)逐漸由單基因向多基因組合以及全基因組水平拓展。2017年Nature Genetics雜志發(fā)表的一篇文章定義了147 888塊緊密耦合的CpG位點(diǎn)，稱為甲基化單倍體塊（CpG methylation haplotypes block，MHB）。經(jīng)過對(duì)61個(gè)全基因組BS測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，并使用101個(gè)BS測(cè)序數(shù)據(jù)集和637個(gè)甲基化芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)大小為95 bp并含有≥3個(gè)CpG位點(diǎn)的MHB在大約170 bp的cfDNA中更容易被檢測(cè)到。最后使用MHB對(duì)59例肺癌或結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和循環(huán)cfDNA進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)借助腫瘤特異的MHB模式可以進(jìn)一步提升甲基化指紋的準(zhǔn)確性，從痕量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)甲基化的組織來源[3]。2017年，通過機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)全基因甲基化譜進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)了4種常見腫瘤的特異性甲基化分子標(biāo)志物，包括肺癌19個(gè)、結(jié)直腸癌6個(gè)、乳腺癌15個(gè)、肝癌3個(gè)。這些標(biāo)志物能夠從正常組織中區(qū)分出腫瘤，準(zhǔn)確率大于95%。進(jìn)一步對(duì)結(jié)直腸癌30例肝轉(zhuǎn)移灶和34例肺轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行無監(jiān)督分層聚類分析，發(fā)現(xiàn)高度組織特異性的甲基化特征可以正確診斷腫瘤起源，診斷正確率分別高達(dá)96.7%和94.1%[4]。與上述研究方法類似，研究人員在大樣本肝癌研究中篩選出10個(gè)甲基化標(biāo)志物，建立起血液肝癌的ctDNA甲基化診斷模型。經(jīng)證實(shí)該模型可以區(qū)分正常人群、肝病背景（肝炎，肝硬化等）和肝癌患者，并與肝癌的腫瘤負(fù)荷、治療反應(yīng)和臨床分期關(guān)聯(lián)良好，再次證實(shí)了ctDNA甲基化檢測(cè)的臨床優(yōu)勢(shì)[5]。

二、ctDNA甲基化檢測(cè)的臨床應(yīng)用

1．ctDNA反映基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的一致特征，可以用于腫瘤診斷：

與DNA突變相比，基因特定啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化可能是癌癥的一致特征，例如，90%的前列腺癌中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）基因被甲基化[6]，96%的乳腺癌中分層蛋白（stratifin，SFN）基因被甲基化[7]，同源框蛋白A9（homeoboxA9，HOXA9）基因和鋸齒狀同源框蛋白1（engrailed homeobox 1，EN1）基因分別在95%和80%的卵巢腫瘤中被甲基化[8]，73%的肝細(xì)胞癌中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因被甲基化[9]。高度一致的甲基化特征使得ctDNA甲基化廣泛地適用于腫瘤診斷。用于診斷的商業(yè)產(chǎn)品也已經(jīng)面市，如基于糞便的結(jié)直腸癌篩查試驗(yàn)將N-myc下游調(diào)節(jié)基因4（N-mycdownstream regulated gene 4，NDRG4）與骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因的甲基化改變與突變檢測(cè)相結(jié)合，在2014年獲得了美國(guó)FDA批準(zhǔn)，是第一個(gè)基于DNA甲基化檢測(cè)的診斷試驗(yàn)[10]。此外，Epi proColon檢測(cè)分析Septin 9基因的甲基化用于全結(jié)直腸癌篩查[11]，以及Epi proLung檢測(cè)分析矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox 2，SHOX2）基因甲基化用于肺癌篩查由中國(guó)FDA于2015年7月批準(zhǔn)[12]。

2．ctDNA甲基化檢測(cè)反映腫瘤負(fù)荷變化，可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)：

癌癥特異性ctDNA甲基化模式可用于定量腫瘤DNA，提供有關(guān)腫瘤負(fù)荷水平的信息。研究表明周期素依賴性激酶抑制因子2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因中位甲基化指數(shù)（甲基化的循環(huán)CDKN2A/總循環(huán)CDKN2A）由術(shù)前35%下降為術(shù)后3.5%[13]。在44%~68%的食管癌患者的腫瘤中檢測(cè)到APC基因的甲基化[14]，食管癌患者術(shù)后血液中腺瘤性結(jié)腸息肉�。╝denomatous polyposis coli，APC）基因甲基化水平與術(shù)后腫瘤殘余顯著相關(guān)[15]。

除了反映手術(shù)后腫瘤負(fù)荷的下降，ctDNA甲基化還可以反映腫瘤對(duì)化療藥物的反應(yīng)。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤需要至少3個(gè)周期的化療，然后才能根據(jù)常規(guī)成像和生物標(biāo)志物來評(píng)估治療反應(yīng)。這種延遲使許多患者暴露于不必要的藥物毒性下，并延誤其他潛在有效的治療時(shí)機(jī)。早期檢測(cè)對(duì)治療藥物的反應(yīng)對(duì)于改善腫瘤患者結(jié)局是必不可少的，目前常規(guī)監(jiān)測(cè)主要通過檢測(cè)血液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物來進(jìn)行。ctDNA甲基化檢測(cè)反映腫瘤負(fù)荷變化的特征使其有望成為監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的新方法。一些研究報(bào)道了在化療期間多個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用ctDNA甲基化定量來監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)，例如使用血漿中ctDNA甲基化GSTP1來追蹤前列腺癌患者對(duì)化療的反應(yīng)。在35例接受多西他賽或米托蒽醌治療的探索性患者隊(duì)列中，首次化療后2~38個(gè)月（中位數(shù)15個(gè)月）內(nèi)血漿甲基化GSTP1水平升高，隨后前列腺特異性抗原（prostate specificantigen，PSA）水平升高，表明血漿甲基化GSTP1可能是較PSA更好的總生存率預(yù)測(cè)指標(biāo)[16]。Fackler等[17]通過全基因組甲基化芯片篩選和TCGA數(shù)據(jù)縮小范圍，最終選擇了10個(gè)基因的甲基化標(biāo)志物用以區(qū)別乳腺癌和健康對(duì)照，然后通過追蹤使用多西他賽和伊馬替尼或卡培他濱治療的29例乳腺癌患者血清中上述標(biāo)志物的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)治療1~2周后上述組合甲基化水平降低，患者疾病穩(wěn)定或部分緩解，無疾病進(jìn)展。持續(xù)追蹤觀察到在臨床疾病進(jìn)展之前可以檢測(cè)到ctDNA甲基化水平升高。此外，血清Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（rasassociation domain family 1A，RASSF1A）和維甲酸受體β2（retinoicacid receptor beta 2，RARB2）基因甲基化水平還被發(fā)現(xiàn)能指示肺癌治療反應(yīng)[18]。

盡管上述研究將ctDNA甲基化降低與腫瘤體積減小相關(guān)聯(lián)，從而評(píng)估化療敏感性，但考慮到血液中ctDNA的半衰期只有2 h，可以提供非�？焖俚尼槍�(duì)腫瘤狀態(tài)變化的測(cè)量，2015年Wang等[19]采取了不同的思路，使用甲基化ctDNA的增加來評(píng)估化療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡的程度。結(jié)果顯示24 h內(nèi)循環(huán)甲基化RASSF1A或APC1的增加與完全/部分化療響應(yīng)相關(guān)，而治療后兩個(gè)標(biāo)志物沒有變化與腫瘤穩(wěn)定/進(jìn)展相關(guān)。這些ctDNA甲基化變化的不同方向可以通過化療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡導(dǎo)致ctDNA的初始水平激增來解釋。與升高時(shí)間相比，化療后ctDNA甲基化下降時(shí)間的范圍從1周到1年不等，這些波動(dòng)強(qiáng)調(diào)了對(duì)化療作出反應(yīng)時(shí)詳細(xì)表征ctDNA動(dòng)力學(xué)的重要性。

3．ctDNA甲基化檢測(cè)可反映腫瘤的預(yù)后、侵襲和復(fù)發(fā)：

甲基化可以通過沉默調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移潛能的基因來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，還可以反映腫瘤亞型，所以其又與腫瘤預(yù)后相關(guān)聯(lián)，許多研究用以指示腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)的可能性。ctDNA甲基化與腫瘤預(yù)后的研究中，所選基因在癌癥相關(guān)過程中功能已知，如細(xì)胞增殖，凋亡等，例如胃癌中X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor 1，XAF1）基因的甲基化與生存率下降有關(guān)，手術(shù)后甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者的中位無病生存期分別為23.4個(gè)月和39.6個(gè)月[20]。性別決定區(qū)Y基因盒17（sexdetermining region Ygene box 17，SOX17）基因通過調(diào)節(jié)WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抑瘤作用，其表達(dá)抑制能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生。兩組研究報(bào)道了血液中SOX17甲基化與食管癌和胃癌的預(yù)后不良有關(guān)。在40例食管癌患者隊(duì)列中，使用包括SOX17等在內(nèi)的8個(gè)基因的啟動(dòng)子和外顯子1區(qū)的9個(gè)CpG甲基化探針用于預(yù)測(cè)預(yù)后，發(fā)現(xiàn)SOX17是多變量分析中的獨(dú)立預(yù)后因素[21]。在另一組73例胃癌患者隊(duì)列中，血清SOX17甲基化與腫瘤分化以及總生存期相關(guān)[22]。RARB2是一種視黃酸受體，通常發(fā)揮抑瘤作用，其甲基化一直被證明與結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌預(yù)后不良相關(guān)[18]。在胃癌中，RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（runt related transcription factor 3，RUNX3）基因術(shù)前血清甲基化水平在晚期階段高于早期階段，且復(fù)發(fā)病例術(shù)前血清RUNX3甲基化明顯高于非復(fù)發(fā)病例，很可能是由于ctDNA甲基化水平反映了腫瘤負(fù)荷。此外，評(píng)估血清RUNX3甲基化和CEA可改善對(duì)結(jié)直腸癌的診斷[23]。

綜上，ctDNA甲基化能克服現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物特異性差，假陽性率高的缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用方面展現(xiàn)出廣闊前景。但是，我們也應(yīng)該意識(shí)到ctDNA甲基化檢測(cè)距離真正進(jìn)入臨床實(shí)踐還有很長(zhǎng)的路要走。主要應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）因?yàn)榕R床試驗(yàn)中抗腫瘤的療效評(píng)價(jià)需要長(zhǎng)期隨訪收集完整的治療信息和預(yù)后信息，目前在臨床上存在較大困難。ctDNA甲基化檢測(cè)應(yīng)注意樣本收集的時(shí)間點(diǎn)，如治療前后對(duì)比來評(píng)估療效，甚至治療全程多時(shí)間點(diǎn)依次收集樣本來監(jiān)測(cè)病程。（2）ctDNA在血液中半衰期較短，其甲基化動(dòng)力學(xué)變化應(yīng)納入考慮。（3）技術(shù)進(jìn)步使得檢測(cè)數(shù)萬個(gè)CpG位點(diǎn)成為可能，但是全基因組ctDNA甲基化檢測(cè)技術(shù)對(duì)生物信息學(xué)提出了更高的要求。（4）ctDNA甲基化標(biāo)志物的診斷效能仍需與其他癌癥循環(huán)生物標(biāo)志物進(jìn)行比較。未來ctDNA甲基化檢測(cè)可用于癌癥個(gè)體化實(shí)時(shí)診治，包括癌癥篩查、診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。