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技術(shù)進(jìn)步是基因治療行業(yè)發(fā)展最根本的驅(qū)動(dòng)力：（1）轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展早、更成熟，是目前基因治療主流技術(shù)，但應(yīng)用受限。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因治療發(fā)展過程中最早出現(xiàn)的治療方法，基本思路即“缺啥補(bǔ)啥”。人工改造的病毒是目前基因治療中最常用的載體。病毒載體優(yōu)化升級則貫穿了整個(gè)基因治療的發(fā)展史，感染效率更高、安全性更好的病毒載體的使用也是近年基因治療取得成功的關(guān)鍵動(dòng)因，但病毒載體仍面臨病毒毒性和免疫原性、基因插入突變、目的基因表達(dá)量難以控制等諸多亟待解決的難題。此外，“缺啥補(bǔ)啥”的治療思路天生就限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用范圍。（2）基因編輯技術(shù)更強(qiáng)大，市場前景廣闊�；蚓庉嫾夹g(shù)優(yōu)勢明顯，有望破除轉(zhuǎn)基因“缺啥補(bǔ)啥”的困境。但由于專利壟斷、新技術(shù)發(fā)明時(shí)間短、風(fēng)險(xiǎn)評估不完善等原因，基因編輯技術(shù)尚未在臨床項(xiàng)目中大面積使用，因此出現(xiàn)時(shí)間更早、技術(shù)更成熟的病毒轉(zhuǎn)基因還是目前基因治療的主流方案。我們認(rèn)為基因編輯的應(yīng)用場景更廣、潛力也更大，是未來基因治療的發(fā)展方向，而此前受到第一代基因編輯技術(shù)——ZFN專利壟斷的限制，整個(gè)基因編輯行業(yè)的發(fā)展停滯了多年，隨著新一代基因編輯技術(shù)（TALEN和CRISPR）的出現(xiàn)，行業(yè)的發(fā)展速度有望得到大幅提升，從而使基因治療再上一個(gè)臺(tái)階。
國外基因治療進(jìn)入成長期，國內(nèi)后來居上仍有潛力：（1）基因治療臨床意義重大，技術(shù)和人才是核心因素。在部分適應(yīng)癥上，基因治療比傳統(tǒng)的治療方案有明顯優(yōu)勢，但我們認(rèn)為基因治療存在的意義是對傳統(tǒng)治療方案的補(bǔ)充，主要用于那些傳統(tǒng)治療方案效果不佳、致病機(jī)制或治療方案非常明確的疾病的治療，如單基因遺傳病、腫瘤CAR-T療法等，故而對于大部分疾病來說，未來傳統(tǒng)治療方案仍是主流。作為新興行業(yè)，我們認(rèn)為能夠解決行業(yè)痛點(diǎn)的關(guān)鍵技術(shù)和人才還是現(xiàn)階段基因治療行業(yè)最大的壁壘。（2）國外多款產(chǎn)品接連上市，研發(fā)管線強(qiáng)勁；國內(nèi)積極追趕，差距正在縮小。近年國外已有幾款基因治療產(chǎn)品上市，臨床在研項(xiàng)目眾多，部分也取得了非常好的效果，進(jìn)入臨床試驗(yàn)后期。綜合來看，國外基因治療行業(yè)已經(jīng)逐步跨入成長期，有望于未來幾年迎來大爆發(fā)。由于起步晚、基礎(chǔ)科研薄弱、政策跟進(jìn)不及時(shí)等原因，在包括基因治療在內(nèi)的創(chuàng)新藥領(lǐng)域國內(nèi)企業(yè)一直落后于國外，更多地是作為國際制藥巨頭的追隨者。因此，目前國內(nèi)基因治療主要集中于國外已經(jīng)取得突破的領(lǐng)域，如CAR-T療法等，故而國外現(xiàn)在處于臨床后期、預(yù)計(jì)在未來兩三年內(nèi)上市的基因治療產(chǎn)品上市后有望再次點(diǎn)燃國內(nèi)市場，產(chǎn)生新的行業(yè)風(fēng)口。此外，基因治療在經(jīng)歷了10多年的行業(yè)大整改之后剛剛進(jìn)入成長期，國內(nèi)外的差距要遠(yuǎn)小于其他傳統(tǒng)醫(yī)藥領(lǐng)域，國內(nèi)企業(yè)仍擁有后來居上的潛力。
一、 基因手術(shù)刀，治療新選擇 基因手術(shù)刀
（一） 基因治療：于遺傳操控的疾病方案
基因治療是指用正常的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以糾正或補(bǔ)充因基因缺陷和異常所引起的疾病，是一種根本性的治療策略。導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因，也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因。
在生物體內(nèi)，遺傳信息沿著“DNA-RNA-蛋白質(zhì)”的方向逐級傳遞（中心法則），蛋白質(zhì)是遺傳信息的表現(xiàn)形式，因此疾病發(fā)生時(shí)多表現(xiàn)為蛋白質(zhì)層面的異常。目前絕大多數(shù)的藥物均以蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)，如治療腫瘤的小分子靶向藥物和大分子單抗藥物，通過改變蛋白質(zhì)的功能來治療疾病�；蛑委焺t是從蛋白質(zhì)的上游——DNA入手，通過調(diào)控DNA來改變遺傳信息傳遞，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的性狀，實(shí)現(xiàn)從源頭上治療疾病。此外，也有少部分藥物，如小核酸藥物Patisiran，以RNA為靶點(diǎn)對疾病進(jìn)行治療，從廣義上來說這類藥物也屬于基因治療的范疇，本文不涉及這類藥物。
根據(jù)中心法則，每一個(gè)生理過程都可以理解為特定的基因在特定的時(shí)間和空間里發(fā)生特定強(qiáng)度表達(dá)的結(jié)果，如果這種平衡被打破就會(huì)誘發(fā)疾病。從這個(gè)角度看，幾乎所有疾病的發(fā)生都可以在DNA水平進(jìn)行解釋，這也是基因治療的理論基礎(chǔ)。根據(jù)基因變異類型的不同，導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因異常大致可分為兩類：（1）基因突變導(dǎo)致基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)功能異常，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)沒有功能、功能變?nèi)趸蚬δ苓^強(qiáng)，甚至產(chǎn)生有害蛋白；（2）基因表達(dá)強(qiáng)度異常，表現(xiàn)為不該表達(dá)的基因表達(dá)、應(yīng)該表達(dá)的基因不表達(dá)、基因表達(dá)的強(qiáng)度過高或過低等。因此，從理論上來說基因治療幾乎可治愈絕大多數(shù)的疾病。然而，疾病的發(fā)生往往涉及多個(gè)基因，對應(yīng)的蛋白質(zhì)之間的相互作用形成了一個(gè)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，僅對某一個(gè)或幾個(gè)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)難以達(dá)到治療疾病的目的。此外，科學(xué)家對人體基因功能和疾病發(fā)生機(jī)制的研究仍然非常有限，存在大量未被發(fā)現(xiàn)的新基因和信號網(wǎng)絡(luò)�；蚝图膊√嗟牟淮_定性極大地限制了基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域，故而基因治療目前只適用于少數(shù)致病機(jī)制或治療方案非常明確的疾病，如單基因遺傳病、腫瘤等。
與常規(guī)的藥物/治療方案相比，基因治療能從源頭上解決疾病的發(fā)生，故而在一些目前無法治療或療效不佳的疾病上有明顯優(yōu)勢，如血友病等。在安全性上，基因治療仍屬于新興技術(shù)，人們對基因和疾病的認(rèn)知還有很多盲區(qū)，且基因更改后通常難以逆轉(zhuǎn)，潛在風(fēng)險(xiǎn)較大；而傳統(tǒng)的藥物治療大多已經(jīng)經(jīng)歷了幾十年甚至上百年的發(fā)展和使用，風(fēng)險(xiǎn)相對可控，因此我們認(rèn)為未來常規(guī)藥物仍然是疾病治療的首選方案，基因治療更多地是作為常規(guī)治療方案的補(bǔ)充，為那些常規(guī)治療方案無效或療效不佳的疾病的患者提供新的選擇。
（二）基因治療的操作流程
根據(jù)給藥方式的不同，基因治療可分為“體內(nèi)”治療和“離體”治療兩大類。
“體內(nèi)”基因治療的操作流程相對簡單，大致可分為3個(gè)步驟：（1）利用基因工程的方法將正�；虿迦氲讲《据d體的DNA上；（2）將重組后的病毒DNA體外包裝產(chǎn)生具有感染能力的完整工程病毒；（3）把重組后的病毒直接注入病人體內(nèi)，病毒感染病變細(xì)胞并將正�；驇У桨屑�(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。
“離體”基因治療可分為6個(gè)步驟：（1）將正�；虿迦氲讲《据d體的DNA上；（2）將重組后的病毒DNA體外包裝產(chǎn)生具有感染能力的完整工程病毒；（3）獲取病人的體細(xì)胞，如造血干細(xì)胞等，體外培養(yǎng)擴(kuò)增；（4）用重組后的病毒感染獲取的病人細(xì)胞，病毒把正�；�?qū)氚屑?xì)胞中；（5）對攜帶正�；虻闹亟M細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增；（6）將攜帶正�；虻闹亟M細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。
（三）歷經(jīng)波折，基因治療終見曙光
以標(biāo)志性歷史事件為分界線，基因治療的發(fā)展大致可分為初期探索、狂熱發(fā)展、曲折前行、再度繁榮4個(gè)階段。
初期探索：1963年，美國分子生物學(xué)家、諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者Joshua Lederberg第一次提出了基因交換和基因優(yōu)化的理念，為基因治療的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)；1970年，美國醫(yī)生Stanfield Rogers試圖通過注射含有精氨酸酶的乳頭瘤病毒來治療一對姐妹的精氨酸血癥，這是首例人體試驗(yàn)，試驗(yàn)以失敗告終。此后幾十年間科學(xué)家又陸續(xù)開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，但這個(gè)時(shí)期治療技術(shù)還不成熟，因此基因治療的發(fā)展也始終不慍不火。
狂熱發(fā)展：1990年，被后人稱為“基因治療之父”的William French Anderson醫(yī)生領(lǐng)銜開展了針對重癥聯(lián)合免疫缺陷病的基因治療，患者為一名美國4歲女孩。接受治療后，其機(jī)體產(chǎn)生腺苷脫氨酶的能力有所提高，病情得到緩解，該患者目前仍然存活。兩年后又有一例基因治療臨床試驗(yàn)取得成功。自此，患者、醫(yī)生和科學(xué)家的熱情迅速被點(diǎn)燃，行業(yè)進(jìn)入狂熱發(fā)展的階段，10年間開展了上千例臨床試驗(yàn)�？傮w而言，這個(gè)時(shí)期的基因治療取得了初步的成功，但技術(shù)上仍存在很大的安全風(fēng)險(xiǎn)，行業(yè)進(jìn)入了短暫的非理性發(fā)展階段。
曲折前行：1999年，美國男孩Jesse Gelsinger參與了賓夕法尼亞大學(xué)的基因治療項(xiàng)目，接受治療4天后因病毒引起的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)導(dǎo)致多器官衰竭而死亡。該事件是基因治療發(fā)展的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。此外，F(xiàn)DA曾于2003年暫時(shí)中止了所有用逆轉(zhuǎn)錄病毒來改造血液干細(xì)胞基因的臨床試驗(yàn)，但經(jīng)過3個(gè)月嚴(yán)格審核權(quán)衡后，又允許基因治療臨床試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。這個(gè)時(shí)期的基因治療相比20世紀(jì)90年在技術(shù)上有所發(fā)展，但仍存在較大的安全隱患，行業(yè)整體上理性發(fā)展。
再度繁榮：2012年，荷蘭UniQure公司的Glybera在歐盟審批上市，用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏引起的嚴(yán)重肌肉疾病。同年，Jennifer Doudna以及美籍華人科學(xué)家張峰發(fā)明了CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，這是基因治療領(lǐng)域革命性的事件。自此，基因治療技術(shù)上的一些瓶頸得到突破，有效性和安全性都有所提高，行業(yè)迎來新一輪的發(fā)展高潮。
二、技術(shù)發(fā)展：“轉(zhuǎn)基因”和“基因編輯”齊頭并進(jìn)
（一）轉(zhuǎn)基因：缺啥補(bǔ)啥
基因治療誕生之初主要用于正�；蚬δ苋笔нz傳病的治療，如聯(lián)合免疫缺陷�。ɑ颊�20號染色體上編碼腺苷脫氨酶的基因出現(xiàn)遺傳突變失去原有的功能），因此對于這類疾病最直接有效的治療思路就是“缺啥補(bǔ)啥”，利用載體將正�；�?qū)牖颊呒?xì)胞內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)治療的目的。目前最常用的載體是人工改造后的工程病毒。
1、病毒載體：大自然賜予基因治療的禮物
天然的病毒對人體細(xì)胞有很強(qiáng)的感染性，能把病毒自身的基因組導(dǎo)入到人體細(xì)胞中，但同時(shí)也具有較強(qiáng)的致病性。以逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞為例，病毒先與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞中，然后病毒攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成為DNA并插入宿主基因組中，這使得病毒的遺傳信息可以永久性地存在于宿主細(xì)胞中并隨細(xì)胞的復(fù)制增殖傳遞給子代細(xì)胞�；谀孓D(zhuǎn)錄病毒的這個(gè)特性，科學(xué)家對病毒進(jìn)行改造，在保留病毒強(qiáng)感染能力的前提下，創(chuàng)造出了復(fù)制缺陷、低毒性的工程病毒，提高病毒使用的安全性，再把正常的人體基因添加到病毒基因組中，正常基因最終隨著病毒基因一起永久地整合到人體細(xì)胞的基因組上，從而達(dá)到基因補(bǔ)償?shù)男Ч�，恢�?fù)病變細(xì)胞的正常功能。
目前臨床上基因治療使用較多的病毒載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相關(guān)病毒（AAV）。
（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒：強(qiáng)大的基因載體，然插入突變成其軟肋
逆轉(zhuǎn)錄病毒呈球形，直徑約為100nm，由兩條相同的單鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶以及包裹其外的核衣殼和包膜組成。
根據(jù)病毒種類的不同，目前常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒可分為兩代。
第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒以γ-retrovirus和C-type retrovirus為代表，是臨床上最早使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒類型。通常所說的逆轉(zhuǎn)錄病毒指的就是第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒。與病毒載體出現(xiàn)之前的常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)勢主要表現(xiàn)為感染效率高、感染細(xì)胞譜系廣、基因穩(wěn)定表達(dá)等。
感染效率高：病毒-細(xì)胞感染模式是由數(shù)億年的生物進(jìn)化和自然選擇發(fā)展而來的，逆轉(zhuǎn)錄病毒對細(xì)胞的感染能力要普遍強(qiáng)于人工的轉(zhuǎn)基因方法，大幅提升了轉(zhuǎn)基因的成功率。
感染細(xì)胞譜系廣：逆轉(zhuǎn)錄病毒對多種動(dòng)物細(xì)胞都表現(xiàn)出較強(qiáng)的感染能力，而此前的轉(zhuǎn)基因方法只對部分特定類型的細(xì)胞有效。
基因穩(wěn)定表達(dá)：逆轉(zhuǎn)錄病毒能把目的基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中，使目的基因穩(wěn)定存在并長期表達(dá)，隨著宿主細(xì)胞的分裂增殖而傳遞給子代細(xì)胞。
然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一把“雙刃劍”，其病毒本身的特性也帶來了諸如病毒毒性、免疫原性、基因插入突變等許多問題。
病毒毒性和免疫原性：盡管科學(xué)家已經(jīng)對逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了一系列的改造，盡可能地降低其對細(xì)胞的毒性，但只要病毒仍具有感染細(xì)胞、整合基因組的能力，即會(huì)對宿主細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生不同程度的影響，存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，改造后的工程病毒仍屬于病毒的范疇，故而存在免疫原性，容易誘發(fā)人體的免疫反應(yīng)，過度的免疫反應(yīng)對人體會(huì)造成不可逆的損傷甚至死亡。
基因插入突變：逆轉(zhuǎn)錄病毒一個(gè)很重要的功能就是能把自身的遺傳物質(zhì)插入到宿主細(xì)胞的基因組中，科學(xué)家也是利用這個(gè)特性進(jìn)行基因治療。然而逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組會(huì)整合到宿主基因的5’非編碼區(qū)，這個(gè)區(qū)域通常對基因的表達(dá)調(diào)控起到很關(guān)鍵的作用，故而逆轉(zhuǎn)錄病毒基因插入容易干擾宿主細(xì)胞正常的基因表達(dá)，甚至激活原癌基因，使細(xì)胞發(fā)生癌變。
只能感染分裂的細(xì)胞：逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂的細(xì)胞，對那些沒有分裂能力的終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞等基因異常導(dǎo)致的疾病無能為力。
感染細(xì)胞不具靶向性：逆轉(zhuǎn)錄病毒對感染的細(xì)胞沒有選擇性，這在一定程度上限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒在臨床上的應(yīng)用范圍，不利于那些需要把目的基因?qū)胩囟?xì)胞類群的“體內(nèi)”基因治療方案。
病毒毒性和免疫原性：盡管科學(xué)家已經(jīng)對逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了一系列的改造，盡可能地降低其對細(xì)胞的毒性，但只要病毒仍具有感染細(xì)胞、整合基因組的能力，即會(huì)對宿主細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生不同程度的影響，存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，改造后的工程病毒仍屬于病毒的范疇，故而存在免疫原性，容易誘發(fā)人體的免疫反應(yīng)，過度的免疫反應(yīng)對人體會(huì)造成不可逆的損傷甚至死亡。
目的基因的表達(dá)量與正常狀態(tài)存在差異：目的基因是裝載到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組上而導(dǎo)入患者細(xì)胞的，受到裝載容量的限制，通常無法把人體基因?qū)?yīng)的表達(dá)調(diào)控元件一起打包到病毒載體里，因此控制目的基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控元件來自病毒本身，故而通過這種方式補(bǔ)償?shù)幕虻谋磉_(dá)水平往往與正常生理狀態(tài)下有所不同，使治療效果打折扣。
針對第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒的局限性，科學(xué)家又做了改進(jìn)，發(fā)明了第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒，主要代表是慢病毒（Lentivirus）、泡沫病毒（Spumavirus）等。以慢病毒為例，第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒主要在感染細(xì)胞類型、裝載容量、基因組插入方式等方面進(jìn)行了優(yōu)化。
對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均可感染：慢病毒突破了“只能感染分裂細(xì)胞”的限制，有助于臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大。
可攜帶的目的基因片段更大：病毒載體對目的基因的裝載容量是有限的，若目的基因片段過大則無法用病毒作為載體導(dǎo)入到患者細(xì)胞中，因此在其他條件都不變的前提下，病毒的裝載容量越大越好。相對于第一代逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒在裝載容量上有所提升。
誘發(fā)癌變的風(fēng)險(xiǎn)降低：慢病毒的基因組通常整合到宿主細(xì)胞基因組的編碼區(qū)，而且是隨機(jī)插入、專一性不強(qiáng)，因此大大降低了慢病毒基因組集中插入到一個(gè)癌癥相關(guān)基因的附近、激活原癌基因的可能性，從而降低了誘發(fā)細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。自2009年第一個(gè)基于慢病毒的基因治療開展以來，截至2015年已經(jīng)有超過300個(gè)臨床試驗(yàn)使用了慢病毒載體，但所有接受治療的患者無一產(chǎn)生癌癥。
慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒大類，故而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共同的弊端仍然存在，如病毒毒性、免疫原性、基因整合引起的宿主基因突變、目的基因的表達(dá)量與正常狀態(tài)不同、細(xì)胞感染不具靶向性等。
（2）腺相關(guān)病毒：非整合型病毒載體大有作為
腺相關(guān)病毒是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，其基因組DNA小于5Kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。腺相關(guān)病毒不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒，如腺病毒、單純皰疹病毒等存在時(shí)才能進(jìn)行復(fù)制、感染并裂解宿主細(xì)胞，否則只能建立溶源性潛伏感染（感染宿主細(xì)胞并潛伏，但不會(huì)裂解宿主細(xì)胞）。
與第一代、第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，腺相關(guān)病毒的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在基因組非整合性和組織靶向性兩個(gè)方面。
基因組非整合性：腺相關(guān)病毒與慢病毒相似，均可感染分裂和非分裂的細(xì)胞，但攜帶目的基因的腺相關(guān)病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞后并不會(huì)插入宿主細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA的形式穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中（部分類型的野生型腺相關(guān)病毒基因組會(huì)插入宿主基因組），并長時(shí)間地合成正常的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。由于“基因組非整合”的特性，腺相關(guān)病毒載體不會(huì)引起宿主細(xì)胞基因組的插入突變，從而提高基因治療的安全性。
組織靶向性：目前科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十幾種腺相關(guān)病毒亞型，不同亞型的病毒對不同組織細(xì)胞有不同的親和性，從而部分解決了病毒載體組織細(xì)胞靶向性的問題。例如，最常用的血清2型腺相關(guān)病毒（AAV2）對骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元、細(xì)胞平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞具有高親和性。
除了病毒載體病毒毒性、免疫原性、目的基因的表達(dá)量與正常狀態(tài)不同的通病以外，腺相關(guān)病毒還存在可攜帶的目的基因片段較小、目的基因易被稀釋等問題。
可攜帶的目的基因片段較�。耗孓D(zhuǎn)錄病毒攜帶目的基因的容量通常在8Kb左右，而腺相關(guān)病毒僅為4.5Kb。
目的基因易被稀釋：腺相關(guān)病毒基因組以游離DNA的形式存在于宿主細(xì)胞，并不插入宿主基因組中，因此在宿主細(xì)胞發(fā)生分裂增殖時(shí)，病毒載體導(dǎo)入的“補(bǔ)償基因”并不會(huì)隨著宿主DNA的復(fù)制而復(fù)制。當(dāng)宿主細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞后，目的基因的數(shù)量也會(huì)被稀釋，最終逐漸丟失，故而腺相關(guān)病毒在感染長期存活的非分裂細(xì)胞或分裂次數(shù)較少的細(xì)胞時(shí)優(yōu)勢較為明顯。
2、非病毒載體：轉(zhuǎn)基因的另一條出路
病毒載體無論如何改進(jìn)，終究會(huì)存在病毒毒性、免疫原性等潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此近年來科學(xué)家嘗試?yán)梅遣《据d體的方式將目的基因運(yùn)送至患者細(xì)胞中，大致可分為物理方法和化學(xué)方法兩大類，其中物理方法的代表是顯微注射、基因槍、電轉(zhuǎn)導(dǎo)等，化學(xué)方法的代表是脂質(zhì)體法、納米顆粒等。
與病毒載體相比，非病毒載體具有低細(xì)胞毒性、弱免疫原性的優(yōu)勢；同時(shí)，非病毒載體的生產(chǎn)流程比病毒載體更標(biāo)準(zhǔn)化，因此大規(guī)模量產(chǎn)要容易得多。然而，非病毒載體比較大的弊端還是低轉(zhuǎn)染效率，即利用非病毒載體把目的基因?qū)爰?xì)胞要做到和病毒載體一樣高效仍比較困難，以及適用的細(xì)胞類型有限，不像病毒載體那樣的廣譜性。目前非病毒載體技術(shù)還在不斷優(yōu)化中，待技術(shù)進(jìn)一步成熟以后，其應(yīng)用范圍也有望得到擴(kuò)大。
（二）基因編輯：破除“缺啥補(bǔ)啥”的困境，極大拓寬基因治療應(yīng)用范圍
利用病毒載體，科學(xué)家已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)部分疾病的基因治療并取得了一些成效。從原理上來看，轉(zhuǎn)基因的治療策略是“缺啥補(bǔ)啥”，因此主要用于基因功能缺失的遺傳病的治療。然而，如果遺傳病不是由某個(gè)基因失去了功能導(dǎo)致的，而是因?yàn)檫@個(gè)基因由于突變獲得了某種不該有的新功能，或者增強(qiáng)了原來就有的舊功能，那么“缺啥補(bǔ)啥”的治療思路就行不通了。對于這類疾病的治療，最根本的辦法是把出錯(cuò)的基因找出來并進(jìn)行糾正，使其恢復(fù)到正常的狀態(tài)，為此科學(xué)家又發(fā)明了基因編輯技術(shù)。從微觀角度看，基因編輯的過程可分為三個(gè)步驟：定位、切除、修補(bǔ)。
定位異�；颍夯蚓庉嫷牡谝徊揭彩亲钪匾囊徊骄褪窃贒NA上找到需要進(jìn)行編輯的位置。人類基因組DNA的大小在3Gb左右，在如此龐大的基因組中準(zhǔn)確找到幾個(gè)甚至一個(gè)出錯(cuò)的堿基是非常困難的，因此需要一套精準(zhǔn)的定位系統(tǒng)來快速鎖定剪切的部位。
切除異�；蚱危憾ㄎ坏侥繕�(biāo)位置以后，需要把錯(cuò)誤的基因片段切除，這個(gè)過程主要通過內(nèi)切酶來實(shí)現(xiàn)。目前科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多種類的內(nèi)切酶，也從中找到了適用于基因編輯的內(nèi)切酶，如Fok I。
修補(bǔ)恢復(fù)成正常基因：內(nèi)切酶把錯(cuò)誤的基因片段切除后，會(huì)在DNA上形成一段缺口，只需要把對應(yīng)的正確基因片段插入到這個(gè)缺口中并與原DNA進(jìn)行連接即可完成DNA的修復(fù)。這個(gè)過程原本非常復(fù)雜，但細(xì)胞偏偏自帶這種功能。為了維持自身DNA的穩(wěn)定，在幾十億年的生物進(jìn)化過程中細(xì)胞進(jìn)化出了一套“DNA修復(fù)系統(tǒng)”，科學(xué)家則巧妙地利用生物體自帶的“DNA修復(fù)系統(tǒng)”實(shí)現(xiàn)了這個(gè)“修補(bǔ)”過程。簡單地說，人體細(xì)胞的DNA是雙拷貝的，當(dāng)一條DNA出現(xiàn)異常時(shí)，這套修復(fù)系統(tǒng)會(huì)以另一條同源DNA為模板，對錯(cuò)誤的DNA進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)人為地把外源DNA（含需要插入的基因）導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，DNA修復(fù)系統(tǒng)會(huì)誤以為該外源DNA是自身同源DNA，并以此為模板對剪切后的DNA進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的插入。
在整個(gè)基因編輯過程中，“準(zhǔn)確定位”是最困難的，也是目前所有的基因編輯技術(shù)最核心的差異所在；“剪切”已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)；“修補(bǔ)”的過程雖然復(fù)雜，但借助于細(xì)胞自帶的DNA修復(fù)系統(tǒng)也基本上解決了這個(gè)問題，所以難度也不大。因此，基因編輯技術(shù)只需要完成“定位”和“剪切”這兩個(gè)步驟就行了。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前的基因編輯技術(shù)主要可分鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALEN）、成簇規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列技術(shù)（CRISPR）三大類。
1、ZFN：開基因編輯先河，操作難度和專利壟斷筑就行業(yè)壁壘
鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）誕生于1996年，由細(xì)胞內(nèi)天然存在的具有準(zhǔn)確識(shí)別和結(jié)合特定DNA序列功能的轉(zhuǎn)錄因子衍生而來。一個(gè)鋅指核酸酶由DNA識(shí)別域和DNA剪切域兩部分組成。
DNA識(shí)別域：通常由3-4個(gè)鋅指蛋白串聯(lián)而成，每個(gè)鋅指蛋白能夠特異地識(shí)別并結(jié)合一個(gè)DNA三堿基序列組合（由A/T/C/G四個(gè)堿基排列而成）。因此，只要將這些特異的鋅指蛋白混合搭配，研究人員或多或少能靶定他們希望的大部分序列，從而使鋅指核酸酶能準(zhǔn)確定位到DNA需要編輯的區(qū)域。
DNA剪切域：由核酸內(nèi)切酶Fok I組成，當(dāng)兩個(gè)Fok I結(jié)合到一起時(shí)就能對DNA進(jìn)行剪切，因此在實(shí)際操作中鋅指核酸酶也是成對使用的，由左、右兩部分組成�；谶@個(gè)原理，鋅指核酸酶成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的定位和剪切，再結(jié)合外源導(dǎo)入的目的基因以及細(xì)胞自帶的DNA修復(fù)系統(tǒng)，即可實(shí)現(xiàn)基因編輯。
從作用原理可以看到，DNA識(shí)別域?qū)NA的精準(zhǔn)識(shí)別和定位是ZFN的核心，而依據(jù)目標(biāo)DNA的序列將3-4個(gè)不同的的鋅指蛋白組合在一起又是重中之重。在1991年，卡爾·帕博（Carl Pabo）團(tuán)隊(duì)就解析出了鋅指蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然而他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每個(gè)鋅指蛋白并不能精確地覆蓋其對應(yīng)的三個(gè)DNA堿基，蛋白本身還會(huì)向前后各“延長”出去一段，插足到相鄰堿基上方，從而干擾了相鄰鋅指蛋白對DNA三堿基序列的識(shí)別。自然界中存在著成千上萬個(gè)鋅指蛋白，因此找到一套行之有效的篩選方法，在浩如煙海的鋅指蛋白庫中找到完美匹配的鋅指蛋白組合成為了ZFN發(fā)展和廣泛應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主阿龍·克魯格（Aaron Klug）團(tuán)隊(duì)利用“噬菌體展示”的方法有效地地解決了這個(gè)難題，但具體的技術(shù)細(xì)節(jié)多年來一直未能被外界所知。
與轉(zhuǎn)基因的基因治療方法相比，ZFN的主要優(yōu)勢在于基因修復(fù)方式多樣、精準(zhǔn)更換基因、對基因表達(dá)強(qiáng)度影響較小。
基因修復(fù)方式多樣：轉(zhuǎn)基因的治療理念是“缺啥補(bǔ)啥”，主要適應(yīng)于基因功能缺失的遺傳病的治療；ZFN的功能更強(qiáng)大，可對錯(cuò)誤的基因進(jìn)行糾正，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)基因的插入和剔除，大大擴(kuò)寬了基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域。
精準(zhǔn)更換基因：ZFN存在一套精準(zhǔn)的DNA定位系統(tǒng)，可對特定的DNA序列區(qū)域進(jìn)行修復(fù)，不同于病毒載體隨機(jī)插入宿主基因組的方式，從而在根本上避免了因外源基因插入引起患者細(xì)胞原有基因組突變致癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
對基因表達(dá)強(qiáng)度影響較小：ZFN實(shí)現(xiàn)的是基因的原位替換，對被糾正基因的表達(dá)調(diào)控元件并不會(huì)產(chǎn)生影響，因此就不會(huì)改變該基因的表達(dá)水平，這與病毒載體有所不同。
ZFN相比轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因治療方面有了質(zhì)的飛躍，也拉開了基因編輯發(fā)展的序幕，但新技術(shù)的發(fā)展同樣也帶來了許多問題。
設(shè)計(jì)/篩選過程復(fù)雜：鋅指蛋白并不完全精準(zhǔn)匹配DNA三堿基序列，需要建立一個(gè)強(qiáng)大的設(shè)計(jì)和篩選平臺(tái)從龐大的鋅指蛋白庫中找出需要的鋅指蛋白組合。這個(gè)過程非常困難和繁鎖，針對不同的基因每次都需要重新走一遍流程、從頭設(shè)計(jì)特定的ZFN工具，且目前國際上僅有少數(shù)的幾個(gè)科學(xué)家掌握了其關(guān)鍵技術(shù)，這就在很大程度上限制了ZFN的臨床推廣和應(yīng)用。
“可編輯性”仍然較低：鋅指蛋白已經(jīng)具備了部分的“可編輯性”，從某種程度上科學(xué)家可以像玩俄羅斯方塊一樣花樣組合不同的鋅指蛋白，實(shí)現(xiàn)對一段特定DNA序列的準(zhǔn)確識(shí)別，但每個(gè)鋅指蛋白對應(yīng)著DNA三堿基序列，而不是一一對應(yīng)，對于基因編輯來說仍然不夠靈活。
存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)：ZFN只通過較短的DNA片段序列（（9-12）×2個(gè)堿基）來實(shí)現(xiàn)鋅指核酸酶的定位，而人類基因組DNA的大小約為3Gb，難免會(huì)在非靶基因的部位出現(xiàn)部分序列的重疊，導(dǎo)致鋅指核酸酶的錯(cuò)誤定位，進(jìn)而產(chǎn)生錯(cuò)誤的基因編輯，發(fā)生脫靶效應(yīng)。
細(xì)胞毒性較大：鋅指核酸酶屬于外源蛋白，導(dǎo)入患者細(xì)胞后會(huì)對細(xì)胞正常的代謝功能產(chǎn)生一定的干擾，表現(xiàn)為細(xì)胞毒性。治療成本較高：ZFN的設(shè)計(jì)和篩選極其繁鎖，且針對不同的基因需要從頭設(shè)計(jì)特定的ZFN工具，導(dǎo)致ZFN工具的構(gòu)造成本非常高，進(jìn)而推高了臨床治療成本。
2、TALEN：首個(gè)真正意義上的基因“可編輯”工具
轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALEN）發(fā)明于2011年，由AvrBs3蛋白衍生而來。TALEN的工作原理與ZFN類似，核心元件的結(jié)構(gòu)也類似，均由DNA識(shí)別域和DNA剪切域組成。轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶通過DNA識(shí)別域結(jié)合到特定的DNA序列上，再由Fok I核酸內(nèi)切酶構(gòu)成的DNA剪切域?qū)Π谢蜻M(jìn)行剪切，最后利用細(xì)胞自帶的DNA修復(fù)系統(tǒng)完成基因編輯。TALEN與ZFN的區(qū)別在于DNA識(shí)別域?qū)NA序列的識(shí)別模式。在ZFN中，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別一個(gè)DNA三堿基序列；在TALEN中，每2個(gè)氨基酸組合對應(yīng)著一個(gè)特定的堿基。因此，通過人為的刪減、添加和自由組合不同的氨基酸組合，科學(xué)家可以輕而易舉地構(gòu)造出結(jié)合特定DNA序列的蛋白，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶在人類基因組DNA上的精確定位。
ZFN相比，TALEN在多個(gè)方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢：工具蛋白設(shè)計(jì)更簡便、可編輯性高、成本降低、細(xì)胞毒性降低。
操作更靈活、設(shè)計(jì)更簡便：ZFN需要利用非常復(fù)雜的方法篩選出完美匹配的鋅指蛋白組合，整個(gè)過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而TALEN只需要根據(jù)目標(biāo)DNA序列把一個(gè)一個(gè)的2氨基酸組合串聯(lián)起來就可以解決問題。由于DNA識(shí)別機(jī)制根本上的差別，TALEN工具蛋白的設(shè)計(jì)比ZFN要簡單得多，更適于科研和臨床應(yīng)用。
可編輯性高：每個(gè)鋅指蛋白對應(yīng)一個(gè)DNA三堿基序列，故而ZFN的設(shè)計(jì)類似對不同俄羅斯方塊的組合，可編輯性較差；TALEN是每2個(gè)氨基酸組合對應(yīng)一個(gè)堿基，氨基酸組可自由組合，可編輯性得到了極大的提高。
脫靶風(fēng)險(xiǎn)降低：有研究表明，在對CCR5基因進(jìn)行基因編輯時(shí)，ZFN技術(shù)對CCR5基因的修正效率為14%，而對高度同源的CCR2基因的改變高達(dá)12%，與目標(biāo)基因CCR5相當(dāng)；TALEN技術(shù)對CCR5基因的修正效率為17%，而對CCR2基因的改變僅為1%。
細(xì)胞毒性降低：相比與ZFN的工具蛋白，TALEN所使用的蛋白對細(xì)胞的毒性也有也下降。
相對于ZFN，TALEN盡管已經(jīng)有了明顯的進(jìn)步，也解決了ZFN一直存在的核心難題，但還有一些缺陷：（1）TALEN的工具蛋白不能通用，針對不同的基因仍需要設(shè)計(jì)特定的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶；（2）脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)；（3）技術(shù)使用成本仍然偏高。
3、CRISPR：當(dāng)之無愧的基因編輯王者
成簇規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列技術(shù)（CRISPR）于2012年由麻省理工大學(xué)的華人科學(xué)家張峰和加州大學(xué)伯克利分校的珍妮弗獨(dú)立發(fā)明。與ZFN、TALEN相比，CRISPR系統(tǒng)是輕量級的基因編輯系統(tǒng)，其DNA定位和剪切元件由Guide RNA（gRNA）和Cas9蛋白組成。CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，gRNA的crRNA部分通過堿基互補(bǔ)原則結(jié)合到目標(biāo)DNA上；借助于gRNA，Cas9蛋白也順利識(shí)別并結(jié)合到需要剪切的DNA部位，再發(fā)揮其DNA剪切活性，使DNA的目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生缺口，進(jìn)而利用細(xì)胞自帶的DNA修復(fù)系統(tǒng)和外源基因?qū)崿F(xiàn)基因編輯。
根據(jù)核心蛋白元件以及用途的不同，目前CRISPR系統(tǒng)可分為2大類、6小類，共19個(gè)亞型，其中研究最多、進(jìn)展最快、應(yīng)用最廣的是第二大類中的II型（CRISPR/Cas9）和V型（CRISPR/Cpf1），用于DNA的基因編輯。與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)具有多方面的優(yōu)勢：（1）系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更簡單：Cpf1蛋白在功能上比Cas9蛋白更集成，分子量也更小，更容易進(jìn)入細(xì)胞，提高基因編輯效率；同時(shí)Cpf1蛋白只需要一個(gè)RNA分子協(xié)助（Cas9至少需要2個(gè)）；（2）DNA剪切方式更優(yōu)：Cpf1蛋白剪切DNA后會(huì)產(chǎn)生黏性末端，便于新DNA序列插入；（3）DNA剪切位置不同：Cpf1蛋白在DNA上的剪切位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)，可編輯位置的選擇余地更大；（4）Cpf1蛋白不同的識(shí)別序列令其基因編輯效果更好；（5）CRISPR/Cas9有一定的脫靶率，而CRISPR/Cpf1幾乎不脫靶；（6）Cpf1在多基因編輯上更有優(yōu)勢。
與ZFN和TALEN相比，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡便、可實(shí)現(xiàn)多基因編輯等。
系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡便、易于操作：以CRISPR/Cas9為例，發(fā)揮DNA剪切功能的Cas9元件是通用的，因此只需要根據(jù)靶基因的不同設(shè)計(jì)相應(yīng)的gRNA即可，其設(shè)計(jì)難度和復(fù)雜度遠(yuǎn)低于ZFN和TALEN，大大拓展了CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用前景。
可實(shí)現(xiàn)多基因編輯：在ZFN和TALEN系統(tǒng)中，每次基因編輯只能實(shí)現(xiàn)一個(gè)基因的改造，而CRISPR系統(tǒng)則突破了這個(gè)限制，可通過在一套CRISPR系統(tǒng)中添加多個(gè)gRNA來實(shí)現(xiàn)多基因編輯，為多基因遺傳病的治療提供了可能。
此外，CRISPR還具有基因編輯效率更高、脫靶風(fēng)險(xiǎn)低、操作成本低等多方面的優(yōu)勢。然而，CRISPR技術(shù)出現(xiàn)時(shí)間還太短，科學(xué)家還無法充分預(yù)估其潛在風(fēng)險(xiǎn)。
可能因人體免疫反應(yīng)而失效：2018年1月，斯坦福大學(xué)兒科血液學(xué)家Matthew Porteus和Kenneth Weinberg領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)在70%的人中都發(fā)現(xiàn)了Cas9同源蛋白的抗體，而超過一半的人都存在其同源物的抗原特異性T細(xì)胞，這意味著CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入人體后可能被人體自身的免疫系統(tǒng)清除而失效，甚至有可能會(huì)引發(fā)人體劇烈的免疫反應(yīng)。至于人體自帶Cas9抗體的原因，科學(xué)家推測Cas9蛋白來源于細(xì)菌，可能在人類進(jìn)化過程中產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體作為保護(hù)機(jī)制。因此，要解決這個(gè)問題，可能需要對Cas9蛋白進(jìn)行修飾而避免人體的免疫反應(yīng)，或者從不存在于人體的微生物中繼續(xù)尋找其他代替Cas9的酶。另一方面，也有不少科學(xué)家對論文結(jié)論的可靠性提出了質(zhì)疑，CRISPR/Cas9的結(jié)局如何還需要等待科學(xué)界最后的評判。
仍可能存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)：CRISPR/Cpf1雖然相對于CRISPR/Cas9在脫靶的問題上已經(jīng)有了明顯的改善，但仍不可避免地存在未知的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)技術(shù)的安全性也需要進(jìn)一步考察。
ZFN因?yàn)閷＠麎艛�、操作�?fù)雜等原因，TALEN和CRISPR則因?yàn)榧夹g(shù)出現(xiàn)時(shí)間太短，基因編輯技術(shù)面世20年后仍未在臨床上大規(guī)模地應(yīng)用。綜合比較，TALEN和CRISPR無疑比ZFN更有優(yōu)勢；僅TALEN和CRISPR而言，二者各有優(yōu)缺點(diǎn)，都屬于相對容易操作的基因編輯系統(tǒng)，CRISPR暫時(shí)不會(huì)完全取代TALEN在臨床上的作用。但長期來看，CRISPR更便捷，隨著其切割元件的不斷優(yōu)化，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢將進(jìn)一步加大，未來基因編輯仍是CRISPR的天下。
三、治療模式：“體外”、“體內(nèi)”各有所長
目前基因治療的模式主要有兩種：“離體”治療和“體內(nèi)”治療。
（一）“離體”治療：技術(shù)難度偏小，可實(shí)現(xiàn)程度更高
“離體”治療的操作對象是從病人身上分離的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞類型的不同可分為兩大類：造血干細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等血液細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞。（1）血液細(xì)胞：收集分離病人血液中特定類型的細(xì)胞后，利用基因改造的方式對細(xì)胞錯(cuò)誤的基因進(jìn)行修復(fù)或使其獲得新的功能，再輸回病人血液中，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。（2）其他類型的細(xì)胞：以遺傳性大皰性表皮松解癥為例，治療時(shí)獲取病人小塊的皮膚，對皮膚細(xì)胞基因改造后，利用細(xì)胞自身的增殖能力，體外培養(yǎng)出較大的皮膚組織，再移植到病人身上，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。
與“體內(nèi)”治療相比，“離體”治療的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在技術(shù)難度較小、對載體的要求較低、安全性更高等幾個(gè)方面。
技術(shù)難度較�。后w外基因改造的技術(shù)方法已經(jīng)較為成熟，臨床上也產(chǎn)生了一些成功的案例。
對載體的要求較低：體外培養(yǎng)環(huán)境對病毒等載體的容忍度要遠(yuǎn)高于體內(nèi)苛刻的環(huán)境，因此對于載體的靶向性、免疫原性等要求都大幅降低。
安全性更高：在體外對細(xì)胞基因修飾后，可作進(jìn)一步的篩選，從中找到優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞對病人進(jìn)行治療，降低安全風(fēng)險(xiǎn)。
然而，“離體”治療也存在很大的局限性，主要表現(xiàn)為候選細(xì)胞種類有限、難以長期保持移植細(xì)胞功效等。
候選細(xì)胞種類有限：通過獲取細(xì)胞、體外改造培養(yǎng)的方式，只能產(chǎn)生細(xì)胞類型單一的組織，細(xì)胞難以自發(fā)形成有功能、組成復(fù)雜、形態(tài)多樣的組織和器官，因此較大程度上限制了“離體”治療的應(yīng)用范圍。由于血液細(xì)胞通常是離散的單個(gè)細(xì)胞，不像其他組織器官那樣是由多種類型的細(xì)胞按照特定的規(guī)律聚集組成，故而“離體”治療方案更適用于血液細(xì)胞相關(guān)疾病的基因治療。
難以長期保持移植細(xì)胞功效：部分細(xì)胞（如T細(xì)胞）的增殖能力有限且有一定的生存周期，改造的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)后會(huì)逐步喪失增殖能力，逐漸死亡而消失，無法使病人獲得長期的治療效果。
綜合“離體”治療的優(yōu)缺點(diǎn)，目前“離體”治療主要還是集中于對T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的改造上。此外，在部分特殊疾病的治療上也取得了一些進(jìn)展，如2015年德國波鴻大學(xué)醫(yī)院的醫(yī)生通過基因編輯的方法成功地對一名遺傳性大皰性表皮松解癥患者進(jìn)行了治療，并取得良好的效果。
（二）“體內(nèi)”治療：應(yīng)用前景廣闊，技術(shù)要求更高
“體內(nèi)”治療操作時(shí)只需要把攜帶目的基因的載體注入病變部位即可，理論上可以實(shí)現(xiàn)任意種類細(xì)胞的基因改造，不再像“離體”治療那樣受到細(xì)胞種類的限制，這是“體內(nèi)”治療相對“離體”治療最大的優(yōu)勢，但在技術(shù)上真正實(shí)現(xiàn)任意細(xì)胞的基因改造目前還有一定難度。此外，“體內(nèi)”治療也省去了“離體”治療的細(xì)胞收集、基因改造、培養(yǎng)擴(kuò)增等繁瑣的操作。
“體內(nèi)”治療的局限性主要在于載體要求高、安全風(fēng)險(xiǎn)大等，因此技術(shù)難度高于“離體”治療。
載體要求高：攜帶目的基因的載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒）對于患者來說是外源性的，故而載體進(jìn)入人體后會(huì)受免疫系統(tǒng)的排斥，使治療效果打折扣；同時(shí)，目前大部分載體靶向性并不好，對組織和細(xì)胞類型沒有選擇性，要實(shí)現(xiàn)把目的基因遞送到特定細(xì)胞中，現(xiàn)階段常用的方法是體內(nèi)定點(diǎn)注射載體，以期讓載體在空間上盡可能地聚集在靶細(xì)胞附近。因此，選擇合適的載體以緩解免疫排斥和靶向性等帶來的問題是“體內(nèi)”治療最關(guān)鍵的要素之一。
安全風(fēng)險(xiǎn)大：相對于“離體”治療，“體內(nèi)”治療在載體的細(xì)胞靶向性、基因靶向性等方面都還需要進(jìn)一步改進(jìn)，容易對正常細(xì)胞產(chǎn)生誤操作，且無法通過篩選剔除誤傷的細(xì)胞，故而比“離體”治療風(fēng)險(xiǎn)更大。
“體內(nèi)”治療的靶組織和器官類型相對分散，目前主要在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血友病、肌肉疾病、視網(wǎng)膜病變等疾病的治療上取得了一些成效。
四、基因治療的行業(yè)現(xiàn)狀：轉(zhuǎn)基因仍是主流，基因編輯潛力巨大
（一）多因素助力基因治療取得成功
基因治療的爆發(fā)始于20世紀(jì)90年代初期，現(xiàn)在再回頭看當(dāng)時(shí)那些基因治療的成功案例，或多或少都帶有一些運(yùn)氣的成分。經(jīng)過近30年科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療越來越成熟，成功率也不斷提高，主要得益于幾個(gè)方面的因素：（1）病毒載體的改進(jìn)提高了治療的有效性和安全性，如目前應(yīng)用最廣的慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體；（2）載體制備和鑒定技術(shù)的發(fā)展使載體的純度和效力都有了較大幅度的提升，既提高了細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成功率，同時(shí)也降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率；（3）基礎(chǔ)的生物學(xué)知識(shí)儲(chǔ)備不斷增加，使得科學(xué)家對靶細(xì)胞、組織和器官的了解也愈發(fā)深入，能更準(zhǔn)確地預(yù)見基因治療能帶來的效果和副作用，提前做好應(yīng)對方案；（4）更細(xì)致的臨床觀察、更有效的分子監(jiān)測也幫助科學(xué)家用更確切的證據(jù)去把握基因治療的療效和安全性；（5）受到1999年美國男孩死亡事件的影響，2000年以后科學(xué)家對基因治療臨床試驗(yàn)的開展更加謹(jǐn)慎，對臨床試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)也做了改進(jìn)，比如招募只表現(xiàn)出早期癥狀的患者參加試驗(yàn)，而不是進(jìn)展至疾病晚期的患者，這也在一定程度上提高了臨床試驗(yàn)的成功率。
（二）技術(shù)和人才是行業(yè)最大的壁壘
盡管目前基因治療在部分領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展，但仍有不少亟待解決的問題�；蛑委熂夹g(shù)上的難點(diǎn)主要是如何提高有效性以及降低安全風(fēng)險(xiǎn)。和許多新興技術(shù)一樣，能夠解決行業(yè)痛點(diǎn)的關(guān)鍵技術(shù)和人才是基因治療行業(yè)目前最大的壁壘。
對于基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因治療來說，現(xiàn)階段遇到的技術(shù)瓶頸主要是（1）病毒載體多缺乏靶向性，并不能特異性地感染病變細(xì)胞，即使不同亞型的腺相關(guān)病毒對某些組織具有部分選擇性，但也遠(yuǎn)達(dá)不到特異識(shí)別的程度，因此進(jìn)行“體內(nèi)”治療時(shí)，目前只能通過局部定點(diǎn)注射的方式，限制了臨床應(yīng)用范圍；（2）目前臨床上廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒在感染宿主細(xì)胞后會(huì)把自身的基因組插入宿主細(xì)胞的基因組中，其插入的位置是隨機(jī)的，存在引起插入突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險(xiǎn)；腺相關(guān)病毒雖然屬于非整合型病毒，但仍存在插入宿主基因組的可能性；（3）理想的基因治療應(yīng)能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同，調(diào)控治療基因以適當(dāng)?shù)乃交蚍绞奖磉_(dá)，但現(xiàn)有的基因?qū)胂到y(tǒng)載體容量有限，不能包容全基因或完整的調(diào)控順序，從而只能借用病毒自帶的基因表達(dá)調(diào)控元件，導(dǎo)致目的基因的表達(dá)量無法調(diào)控，也不能達(dá)到正常生理狀態(tài)下的表達(dá)水平；（4）病毒載體具有一定的毒性和免疫原性，注入患者體內(nèi)后容易被人體的免疫系統(tǒng)所清除，同時(shí)也帶來副作用；（5）病毒載體的基因?qū)胄嗜杂羞M(jìn)一步提升的空間。對于基于基因編輯技術(shù)的基因治療來說，關(guān)鍵的技術(shù)難點(diǎn)主要是（1）基因編輯技術(shù)，特別是CRISPR技術(shù)面世的時(shí)間還太短，存在太多不確定的因素，再加上科學(xué)家對人類基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知還非常不足，輕易改動(dòng)基因可能引發(fā)無法預(yù)見的安全問題；（2）基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞的效率和基因編輯的效率都還不高，尚無法真正實(shí)現(xiàn)臨床上的大規(guī)模應(yīng)用；（3）基因編輯系統(tǒng)與病毒載體一樣也不具有細(xì)胞靶向性。
無論轉(zhuǎn)基因技術(shù)還是基因編輯技術(shù)，要解決當(dāng)前臨床應(yīng)用面臨的技術(shù)難題，對載體和系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化升級都是最直接、最有效也是無法回避的方式。此外，基因治療多為個(gè)體化的治療方案，真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化還需要做出較大的優(yōu)化和改進(jìn)。除了技術(shù)上的瓶頸，基因治療還存在專利壁壘和倫理糾紛等非技術(shù)障礙。
（四）基因治療的臨床應(yīng)用：重點(diǎn)布局腫瘤和遺傳病
1、CAR-T：“離體”基因治療目前最成功的應(yīng)用
CAR-T治療（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療）是“離體”基因治療目前在臨床上最成功的應(yīng)用。CAR-T技術(shù)現(xiàn)階段主要用于血液腫瘤的治療，主要代表是FDA于2017年批準(zhǔn)的Kymriah（諾華）和Yescarta（Kite）兩款產(chǎn)品；實(shí)體腫瘤的治療尚屬于探索階段，還需要等待技術(shù)上出現(xiàn)革命性的突破。病人接受CAR-T治療時(shí)，科學(xué)家先從病人的外周血中分離得到T細(xì)胞，再利用慢病毒等載體將人工改造的目的基因?qū)隩細(xì)胞，使T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成CAR-T細(xì)胞，從而獲得了特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；待CAR-T細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至一定數(shù)量后，再回輸給病人，實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療。
以白血病為例，傳統(tǒng)的化療和放療在臨床上已經(jīng)使用了幾十年，對大部分的白血病有效，療效和副作用都相對明確，故而現(xiàn)階段仍是臨床上首選的治療方案，但化療和放療對一部分病人的治療效果并不理想。因此，CAR-T的意義在于給這些傳統(tǒng)療法無效的患者提供新的治療方案，并且多個(gè)CAR-T產(chǎn)品均已在臨床上取得了非常好的治療效果。然而，白血病只是CAR-T臨床應(yīng)用的起點(diǎn)，且目前CAR-T尚作為三線治療方案，未來隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和成熟，CAR-T技術(shù)有望在除白血病之外的其他血液腫瘤乃至實(shí)體腫瘤的治療上取得突破，這將徹底改變目前腫瘤治療的格局，擁有很大的成長空間。
2、地中海貧血：基因治療有望顛覆現(xiàn)有治療方案
地中海貧血即珠蛋白生成障礙性貧血，患者通常表現(xiàn)出常見的貧血狀態(tài)以及相應(yīng)的并發(fā)癥，其致病機(jī)制是珠蛋白基因缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，導(dǎo)致血紅蛋白的組成成分改變，進(jìn)而引發(fā)紅細(xì)胞壽命縮短，表現(xiàn)為慢性溶血性貧血。地中海貧血屬于常染色體隱性基因遺傳病，當(dāng)夫妻雙方均為致病基因的攜帶者時(shí)，其后代有25%的概率會(huì)患病，50%的概率為致病基因攜帶者，25%的概率基因完全正常。
針對地中海貧血，目前臨床上常規(guī)的治療方案是定期輸血，患者需要終身治療，治療費(fèi)用昂貴，且容易產(chǎn)生輸血副反應(yīng)；根治方案是進(jìn)行造血干細(xì)胞移植，將健康人的造血干細(xì)胞植入病人體內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)疾病的治愈，但最大的障礙是造血干細(xì)胞配型非常困難，即使配型成功，多數(shù)病人接受治療后仍需長期服用免疫抑制性藥物。最有前景的治療方案是基因治療，從病人的外周血中收集造血干細(xì)胞后，利用病毒載體將正常的珠蛋白基因?qū)肫渲�，使�?xì)胞功能恢復(fù)正常，再將改造后的造血干細(xì)胞回輸給病人。造血干細(xì)胞來源于病人自身，因此不存在配型和排斥的問題。改造的造血干細(xì)胞進(jìn)入病人體內(nèi)后，會(huì)源源不斷地產(chǎn)生功能正常的新的紅細(xì)胞，從而達(dá)到緩解甚至治愈疾病的目的。綜合比較，目前臨床上地中海貧血的治療方案都存在諸多缺陷，而基因治療則在很大程度上填補(bǔ)了這個(gè)臨床未滿足需求，待技術(shù)進(jìn)一步成熟后，有望在臨床上迅速得到推廣，進(jìn)而取代目前并不完美的治療方案。
3、鐮刀型細(xì)胞貧血：基因編輯或?qū)⒛ǔ匀贿x擇的“印跡”
鐮刀型細(xì)胞貧血是一種常染色體隱性基因遺傳病，主要見于非洲黑人，也見于中東、希臘、土籍印第安人及與上述民族長期通婚的人群。正常的紅細(xì)胞呈圓餅狀，而患者的紅細(xì)胞呈鐮刀狀，其攜帶氧的功能只有正常紅細(xì)胞的一半�；颊叱錾肽旰蟀Y狀逐漸出現(xiàn)，除了表現(xiàn)出貧血的相關(guān)癥狀外，臨床上患者還常伴有生長發(fā)育遲緩、骨骼發(fā)育異常等表現(xiàn)。
鐮刀型細(xì)胞貧血的病理在于β-珠蛋白基因發(fā)生單堿基突變，改變了β-珠蛋白的氨基酸序列，導(dǎo)致血紅蛋白溶解度下降，進(jìn)而形成管狀凝膠結(jié)構(gòu)，引起紅細(xì)胞扭曲成鐮刀狀。由于形態(tài)異常，鐮刀型紅細(xì)胞易在細(xì)微血管分支處聚集，造成血管阻塞，嚴(yán)重者甚至死亡。
目前鐮刀型細(xì)胞貧血尚無法治愈，臨床上采用的治療方案多只能緩解癥狀，如輸血、造血干細(xì)胞移植等，而基因治療有望對鐮刀型細(xì)胞貧血進(jìn)行根治。不同于地中海貧血轉(zhuǎn)基因的治療方案，鐮刀型細(xì)胞貧血需要對患者自身錯(cuò)誤的基因進(jìn)行糾正，故而在采集病人的造血干細(xì)胞后，可利用基因編輯技術(shù)，把突變的基因變回正常的基因，使造血干細(xì)胞的功能得到恢復(fù)，再將改造后的造血干細(xì)胞回輸給病人，實(shí)現(xiàn)疾病的治療。
4、艾滋�。簭呐既会t(yī)療事件到基因治療
艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征，由人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起。HIV進(jìn)入人體后，主要攻擊CD4陽性的T淋巴細(xì)胞，破壞人體的免疫系統(tǒng)，最終患者多因免疫系統(tǒng)崩潰而罹患腫瘤或受其他病原體感染致死。研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染T細(xì)胞需要由細(xì)胞表面的多種蛋白共同介導(dǎo)，因此阻斷這些蛋白與HIV的識(shí)別有望治愈艾滋病。
科學(xué)家曾偶然發(fā)現(xiàn)一名艾滋病患者在接受骨髓移植后其體內(nèi)的HIV消失了，這意味著這名患者的艾滋病被骨髓移植治愈了。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其骨髓捐獻(xiàn)者天然攜帶CCR5△32這種基因變異，而該基因原型CCR5是介導(dǎo)HIV感染T細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白之一，這種基因突變阻斷了HIV感染T細(xì)胞的途徑，使T細(xì)胞獲得了抵抗HIV的特殊能力。因此，通過基因編輯的方式，將患者造血干細(xì)胞的CCR5基因替換成CCR5△32，即可使患者新生成的T細(xì)胞獲得抵抗HIV的能力，再輔以抗病毒藥物的治療，有望實(shí)現(xiàn)艾滋病的治愈。該技術(shù)成熟以后，將徹底終結(jié)目前“談艾色變”的局面。
5、血友�。夯蛑委熥尅巴鈧鲅辈辉倏膳�
常見的血友病（A型和B型血友�。┦荴染色體連鎖的隱性基因遺傳病�；颊咭蚰蜃踊蛉毕輰�(dǎo)致凝血功能障礙，臨床表現(xiàn)為終身輕微外傷即發(fā)生長時(shí)間出血。凝血因子有很多種，每種凝血因子均在凝血的過程中發(fā)揮重要作用，不同凝血因子基因的缺陷會(huì)產(chǎn)生不同類型的血友病，臨床均表現(xiàn)為凝血障礙。
目前臨床上血友病的治療方案主要是替代治療，即給患者注射其血液中缺少的凝血因子。這種治療方案的缺陷很明顯，不能治愈、需要終身治療，治療費(fèi)用非常昂貴�；蛑委煹乃悸贩浅Ｃ鞔_——缺啥補(bǔ)啥，只需要利用轉(zhuǎn)基因的方式給患者自身的細(xì)胞補(bǔ)充其缺失的凝血因子基因即可。凝血因子主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，因此血友病基因治療的操作對象是患者的肝細(xì)胞。不同于地中海貧血和鐮刀型細(xì)胞貧血的治療，“離體”基因治療方案在血友病中行不通，只能采取體內(nèi)治療的方式。通過原位注射將攜帶正常基因的病毒載體注入肝組織中，病毒載體再把正�；�?qū)敫渭?xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的補(bǔ)償，治愈血友病。
6、溶瘤病毒：從“惡魔”到“天使”的華麗變身
溶瘤病毒是基因治療在腫瘤治療上的另一個(gè)應(yīng)用。通過基因改造，科學(xué)家賦予了傳統(tǒng)病毒全新的功能：（1）溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞后能大量增殖并使腫瘤細(xì)胞發(fā)生裂解，但在正常細(xì)胞中溶瘤病毒的增殖受到限制，降低了副作用；（2）改造后的溶瘤病毒攜帶某些能抑制腫瘤細(xì)胞分裂的基因，當(dāng)病毒感染腫瘤細(xì)胞后會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的控制；（3）某些改造后的溶瘤病毒具有腫瘤細(xì)胞靶向性，進(jìn)一步提高了腫瘤殺傷效果，降低了副作用。溶瘤病毒是目前眾多腫瘤治療方案的一部分，技術(shù)成熟后有望單獨(dú)使用或和其他治療方案聯(lián)合使用，提高腫瘤的可治愈性。
國內(nèi)醫(yī)藥企業(yè)也緊跟國際技術(shù)發(fā)展前沿，目前有幾百家公司開展與基因治療相關(guān)的業(yè)務(wù)，主要集中在東部沿海一帶。雖然基因治療在國內(nèi)如火如荼地開展，但與國外還有不小的差距，我們認(rèn)為這個(gè)現(xiàn)象是中國醫(yī)藥生物的科研和技術(shù)水平長期落后于國外導(dǎo)致的，不僅僅只是基因治療這一個(gè)領(lǐng)域。從全球范圍來看，基因治療在經(jīng)歷了10多年的行業(yè)大整改之后剛剛進(jìn)入快速發(fā)展的階段，國內(nèi)外的差距要小于其他傳統(tǒng)醫(yī)藥領(lǐng)域，國內(nèi)企業(yè)仍擁有后來居上的潛力。
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