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2017年8月，俄勒岡國家靈長類動物研究中心Shoukhrat Mitalipov等利用CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)修正了未被植入子宮前的人類胚胎中一種和遺傳性心臟疾病有關(guān)的變異，并進一步證實編輯人類生殖細胞系（卵子、精子或早期胚胎）的DNA是安全有效的。該文章發(fā)表后不久，六位科學家聯(lián)名在預印本雜志bioRxiv上發(fā)表文章質(zhì)疑Nature文中的一個關(guān)于“細胞主要利用自身序列進行修復”的結(jié)論，該質(zhì)疑論文發(fā)表后引起了媒體的廣泛關(guān)注。事情過去了差不多正好一年，近日Nature以Brief Communications的形式一次性發(fā)表了3篇相關(guān)文章，其中兩篇文章主要是是質(zhì)疑此前Nature中的結(jié)論，而另一篇則是來自Mitalipov組的文章是針對質(zhì)疑做出的回應(yīng)。

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的抵御入侵病毒或者外源DNA的一種獲得性免疫防御機制，通過該系統(tǒng)細菌實現(xiàn)自我保護。2013年初，兩個實驗組將CRISPR/Cas9技術(shù)成功的在小鼠以及人細胞內(nèi)實現(xiàn)精確的基因編輯。隨后引發(fā)了CRISPR/Cas9的井噴式發(fā)展，在基因編輯領(lǐng)域表現(xiàn)出來的巨大潛力和廣闊的應(yīng)用前景，是以往任何一項基因編輯技術(shù)無法比擬的。

2017年，Nature發(fā)表了美國科學家Shoukhrat Mitalipov等成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)在人類早期病原性胚胎中修復導致先天性肥厚型心肌病基因突變的研究成果。這一工作不僅表現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)在生殖細胞基因編輯治療遺傳學疾病的巨大潛能，同時也提出了iPS細胞與人類胚胎對Cas9 切割的雙鏈DNA斷裂(DSB)可能存在不同的修復機制。在攜帶雜合突變iPSC細胞中，DSB主要利用外源ssDNA為模板進行同源重組修復（HDR）。然而在人類胚胎中，受精18小時后原核期注射CRISPR/Cas9的胚胎組所有的突變allele都利用內(nèi)源的WT allele作為同源重組模板，僅在通過與精子同時注射到MII卵母細胞的胚胎組中，存在一個卵裂球選擇了外源ssDNA作為模板進行修復。截然不同的結(jié)果說明早期胚胎中有著較iPSC細胞更為精細的HDR修復機制，在選擇DSB修復模板中可能存在著更為精細的模板識別校對機制。

這一工作引發(fā)了不僅全球社會人士以及科學家的熱點關(guān)注，也帶來了包括哥倫比亞大學Dieter Egli， 發(fā)育生物學家Maria Jasin 以及 George Church在內(nèi)的一些干細胞科學家的質(zhì)疑（下圖）。爭論的焦點在于Egli等認為受精后，卵子和精子的基因組分別位于受精卵的兩端，很難跨越巨大的距離發(fā)生內(nèi)源性的HDR。他們認為精子中的突變并沒有真正的修復，而是CRISPR/Cas9造成的大片段丟失大于PCR檢測的534bp, 而導致PCR過程中只檢測到WT 母源allele, 并沒有真正檢測到突變精子來源的父源allele, 同時也有可能是卵子中并沒有精子參與，而是孤雌激活形成的胚胎。

同樣，來自澳大利亞阿德萊德大學的Paul Thomas等發(fā)現(xiàn)在小鼠CRISPR/Cas9編輯胚胎中存在大片段丟失（下圖），他們因此認為是人胚胎中可能也存在突變位點大片段丟失，而導致未檢測到mutant allele，錯誤的以為發(fā)生了HDR修復。

同時，Mitalipov研究組也在Nature上針對這些疑問進行了后續(xù)實驗回應(yīng)相關(guān)質(zhì)疑（下圖）。他們通過對突變修復的多個胚胎的不同卵裂球進行覆蓋突變位點493bp到10160bp不同長度的8組大片段PCR來回應(yīng)不存在大片段缺失。通過對修復的單個卵裂球的SNP位點分析發(fā)現(xiàn)，其中部分修復卵裂球多個SNP位點均失去了雜合性，且轉(zhuǎn)換成純合的母源nucleotides。 而部分修復的卵裂球僅離突變位點距離較近的SNP位點轉(zhuǎn)換成了純合的母源nucleotides，距離較遠的SNP位點仍保留了分別來自卵子和精子的不同的nucleotides。 這一結(jié)果不僅說明了父源基因的存在排除孤雌激活形成的胚胎，同時也印證了突變精子利用同源的WT母源allele 作為模板進行HDR修復。

由此看來，內(nèi)源性的HDR在CRISPR/Cas9介導的人類胚胎修復中起到了主導性作用，存在著較細胞更為精密修復的模板識別校對機制。這與中山大學黃軍就研究員在對人類三原核受精卵中的研究結(jié)果也是一致的。其實早在2013年，中科院生化所李勁松研究員在利用CRISPR/Cas9治療小鼠白內(nèi)障疾病中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了小鼠胚胎可以利用內(nèi)源的WT allele作為模板進行修復，加入外源DNA模板，并不能顯著提高HDR修復效率。利用母源WT allele為模板修復的小鼠，不僅自身白內(nèi)障疾病得到修復，并且可以穩(wěn)定遺傳給下一代健康的基因型和表型。但與人類胚胎不同的是在存在外源DNA模板的情況下，小鼠胚胎既可以選擇外源DNA作為模板也可用內(nèi)源WT allele.這也可能暗示著胚胎有較細胞更為精密的修復機制，而人類胚胎較小鼠胚胎又有著更加嚴謹?shù)哪０遄R別校對。

值得一提的是，今年年初，來自美國麻省理工的馮國平教授在線發(fā)表在biorxiv上對小鼠胚胎利用CRISPR/Cas9進行小鼠胚胎knock in 的研究中獲得了高效率的純合knock in 小鼠 , 并且存在多個胚胎的兩個allele發(fā)現(xiàn)同樣的非同源末端接合（NHEJ）修飾（下圖）。NHEJ 會造成DSB斷裂處堿基的隨機丟失或者插入，多個胚胎純合NHEJ的發(fā)生更可能是來自內(nèi)源性的HDR 而不是隨機的堿基修飾，其中一條allele利用已經(jīng)發(fā)生NHEJ的allele作為模板，進行HDR修復。這一工作進一步肯定了HDR在早期小鼠胚胎的DSB修復中起到主導作用。

我們知道在受精卵形成過程中，精子經(jīng)過染色質(zhì)凝聚形成雄原核，隨著卵母細胞完成第二次減數(shù)分裂，雄原核增大，并促使雌雄原核朝彼此的方向遷移，在遷移過程中完成各自DNA的復制，雌雄原核會合后，核膜崩解，雌雄原核核物質(zhì)融合成合子。而在這個之前，父源DNA和母源DNA始終都是分開的，內(nèi)源性HDR是如何發(fā)生的呢？CRSIRP/Cas9 介導的精子基因組上DSB會招募母源WT 染色體靠近還是CRSIRP/Cas9 介導的精子基因組上DSB會一直保留到雌雄原核融合以后才進行HDR修復？

我們并不完全了解人胚胎細胞中的最初階段的生物機制，仍然需要更多的工作去研究不同的遺傳疾病，不同的位點是否仍然存在同樣的精確的修復機制，內(nèi)源性HDR在雌雄原核分開的情況下是如何發(fā)生的，該論文研究結(jié)果對我們重新認識胚胎中的DNA修復機制有著重要的指導作用，對人類生殖遺傳疾病治療提供理論基礎(chǔ)。