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“預(yù)防就是治療”--《眾病之王：癌癥傳》

戰(zhàn)勝癌癥，早期預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)是關(guān)鍵。癌癥患者如果在晚期被發(fā)現(xiàn)，90%的患者都會(huì)死亡，而腫瘤在早期發(fā)現(xiàn)，5年的存活率是90%。早期發(fā)現(xiàn)惡變細(xì)胞蹤跡，可以通過(guò)干預(yù)手段，提高自身免疫力，也可以完整切除，結(jié)合化療，治療疾病。

微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，是一種對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的方法。

可以對(duì)腫瘤早期進(jìn)行篩查，項(xiàng)目可一次性檢測(cè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的 9 個(gè)基因 48 個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)，覆蓋常見(jiàn)惡性腫瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤等。

只需抽取受檢者 4ml 外周血，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤早期無(wú)創(chuàng)檢測(cè)�？梢葬槍�(duì)性的對(duì)高危人群、有腫瘤家族史易感人群、癌前病變?nèi)巳�、疑似腫瘤人群、癌癥康復(fù)人群進(jìn)行腫瘤篩查檢測(cè)，從分子層面鑒定是否有基因突變，控制癌前病變。

DDPCR的原理是在PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

其靈敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其適用于痕量、不易得到的待檢樣品；彌補(bǔ)了第二代 PCR 系統(tǒng)難以精確測(cè)定基因拷貝數(shù)、無(wú)法對(duì)痕量突變定性和定量、精確度低等缺點(diǎn)。滿(mǎn)足更多臨床檢驗(yàn)的需求，更精確，更數(shù)字化。非常適合一些稀有樣本中核酸的精確檢測(cè)，用于腫瘤的早期篩查、腫瘤繼發(fā)性耐藥檢測(cè)及腫瘤負(fù)荷實(shí)時(shí)監(jiān)控等。

微滴式數(shù)字PCR的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

單分子分析：將微量臨床樣本再細(xì)分成 2 萬(wàn)個(gè)微滴，實(shí)現(xiàn)臨床樣本的“單分子分析”。

真正意義上的絕對(duì)定量，可統(tǒng)計(jì)突變率：無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線；檢測(cè)下限可低至單拷貝；不依賴(lài)ct值，不依賴(lài)擴(kuò)增效率，能克服 PCR 抑制劑的影響。

不再依賴(lài)Cq值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目。（Cq值：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物（熒光信號(hào)）到達(dá)閾值（進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期）所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)）。

數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化：每個(gè)微滴的檢測(cè)結(jié)果以陰性、陽(yáng)性標(biāo)示，由設(shè)備直接判斷，通過(guò)把樣本稀釋成許多部分，然后在一個(gè)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)候?qū)ζ溆?jì)數(shù)。靈敏度可高達(dá)0.001%,顯著高于擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（0.1%）和sanger法測(cè)序（10%）。

克服了傳統(tǒng)PCR系統(tǒng)高成本、通量有限、流程復(fù)雜、精確度低等缺點(diǎn)。

使用靈活：可按實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整通量和靈敏度。

微滴式數(shù)字PCR的應(yīng)用

定量癌癥標(biāo)志物

與野生型DNA的背景下，癌癥相關(guān)突變因濃度低，往往逃過(guò)檢測(cè)。微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)以其高靈敏度，能夠輕松定量低至0.0001%的突變，這是其他方法無(wú)法做到的。

區(qū)分基因組變異

拷貝數(shù)變異（CNV）是人類(lèi)基因組中個(gè)體差異的一個(gè)重要來(lái)源。CNV與癌癥、神經(jīng)和自身免疫疾病以及藥物的不良反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)�？煽康罔b定此類(lèi)CNV，也代表了前沿研究中一種重要的能力。

研究病毒載量

在確定疾病狀態(tài)和開(kāi)發(fā)有效療法時(shí)，精確地定量病毒載量至關(guān)重要。病毒庫(kù)不斷波動(dòng)，有時(shí)會(huì)降至極低的水平。在研究許多不同的病原體時(shí)，成功和失敗之間也許就一步之遙，那就是能夠準(zhǔn)確重復(fù)地測(cè)定病毒DNA或RNA。

之前，美國(guó)密西西比州一名出生時(shí)攜帶艾滋病毒的嬰兒，經(jīng)過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療，已經(jīng)被“功能性治愈”。在這個(gè)案例中，ddPCR平臺(tái)發(fā)揮了重要的作用。研究人員表示，它通過(guò)將樣品隨機(jī)分布在上萬(wàn)個(gè)微滴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而確保了高度靈敏而準(zhǔn)確的HIV DNA低拷貝分析。

新一代測(cè)序的驗(yàn)證

美國(guó)福瑞德?哈金森癌癥研究中心的研究人員去年在《BioTechniques》雜志上發(fā)表文章，稱(chēng)ddPCR可作為一種精確的方法，用于NGS文庫(kù)的質(zhì)量控制。

在新一代測(cè)序的樣品制備中，準(zhǔn)確定量測(cè)序文庫(kù)很關(guān)鍵，這可保證測(cè)序平臺(tái)的高效利用。若測(cè)序運(yùn)行時(shí)的文庫(kù)分子過(guò)多或過(guò)少，都會(huì)使數(shù)據(jù)質(zhì)量受損，有時(shí)甚至沒(méi)有數(shù)據(jù)。這不僅浪費(fèi)寶貴的樣品和試劑，也浪費(fèi)用戶(hù)和儀器的時(shí)間。ddPCR系統(tǒng)可以融入NGS的文庫(kù)制備流程中，精確定量測(cè)序文庫(kù)。

基因表達(dá)分析

準(zhǔn)確定量樣品中存在的RNA轉(zhuǎn)錄本，有助于更好地了解基因表達(dá)和調(diào)控。ddPCR系統(tǒng)以其高靈敏度，特別適合發(fā)現(xiàn)和定量稀有轉(zhuǎn)錄本，讓研究人員更深入地探究單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，并更好地了解RNA的實(shí)際功能。同時(shí)，其高精確度也使其能夠檢測(cè)樣品之間基因表達(dá)的微小變化。

去年發(fā)表在《Nature Methods》上的一篇文章稱(chēng)，ddPCR技術(shù)能在不同情況下，準(zhǔn)確重復(fù)地定量血漿和血清中的microRNA。作者認(rèn)為ddPCR能幫助我們更加精確地追蹤病人在治療期間不同時(shí)間段中的血清microRNA濃度變化情況，這對(duì)于實(shí)時(shí)PCR來(lái)說(shuō)，有時(shí)是不可能實(shí)現(xiàn)的。

總體來(lái)說(shuō)，ddPCR的優(yōu)點(diǎn)就是能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)出微量基因的變化及差異，提供給我們更可靠的數(shù)據(jù)，尤其是在臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域其作用非常重要。