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傅啟華教授:博士研究生導(dǎo)師、研究員、主任技師、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所常務(wù)副所長(zhǎng)、出生缺陷研究室主任；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心科研部主任、精準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)驗(yàn)診斷中心執(zhí)行副主任；全國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)企業(yè)管理協(xié)會(huì)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任委員。

第五屆博德中國(guó)（國(guó)際）體外診斷高峰論壇上，傅啟華教授帶來了“分子診斷技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的思考”的精彩演講。

傅啟華教授在報(bào)告指出，分子診斷不僅能對(duì)早期疾病作出確切的診斷，也能確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并對(duì)疾病的分期、分型、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后作出判斷。早期分子診斷并不是一門獨(dú)立的學(xué)科，目前已成為實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的一個(gè)重要組成部分，成為一門新的學(xué)科——分子診斷學(xué)。傅教授分析了PCR技術(shù)，測(cè)序技術(shù)，生物芯片技術(shù)三種主要的分子診斷技術(shù)，并從發(fā)展歷史、臨床轉(zhuǎn)化等方面出發(fā)作了思考及分享。

PCR技術(shù)發(fā)展

PCR技術(shù)衍生出很多其他技術(shù)，如：PCR產(chǎn)物電泳分析、PCR-RFLP、PCR-ASO、多重PCR、PCR/測(cè)序分析、定量PCR等等。PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，病毒DNA或RNA的定量PCR檢測(cè)、血友病等遺傳性疾病的基因診斷、癌基因或抑癌基因的檢測(cè)、細(xì)菌的基因分型等等。

定性PCR

PCR技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)80年代中旬發(fā)明的。定性PCR是最早應(yīng)用的，可以用于很多檢測(cè),如基因突變檢測(cè)，微生物檢測(cè)等。定性PCR的優(yōu)點(diǎn)主要有技術(shù)要求低、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等等，它僅僅依據(jù)電泳通過判斷微生物的有無，或者是某個(gè)基因突變的有無來判斷疾病，其局限性主要是依據(jù)參照判斷目標(biāo)片段是否存在，準(zhǔn)確性不高，實(shí)驗(yàn)可靠性有待提高，容易造成假陰性結(jié)果。

熒光定量PCR

上世紀(jì)90年代末，發(fā)展了熒光定量PCR，該技術(shù)發(fā)展以后，PCR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室里面得到了大大的推廣應(yīng)用。熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)很多，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，容易實(shí)現(xiàn)精確定量檢測(cè)，重復(fù)性好；可半自動(dòng)化和批量檢測(cè)，24～48h內(nèi)能得到結(jié)果，在高通量檢測(cè)、價(jià)格低廉、可質(zhì)量控制等方面具有突出優(yōu)勢(shì)，有望解決產(chǎn)前診斷技術(shù)資源的“缺口” 問題。我國(guó)最早期使用傳染病的PCR檢測(cè)，如乙肝病毒，丙肝病毒等。從遺傳性疾病檢測(cè)方面看，熒光定量PCR具有局限性，它不能檢測(cè)染色體平衡易位、倒位及低水平嵌合等。熒光定量PCR可以應(yīng)用于染色體非整倍體、三倍體、母體細(xì)胞污染鑒定以及個(gè)體識(shí)別等方面。

數(shù)字PCR

本世紀(jì)初發(fā)明數(shù)字PCR，通過有限稀釋將樣本分配到獨(dú)立區(qū)室，每個(gè)區(qū)室最多只有一個(gè)拷貝的模板，各區(qū)室進(jìn)行獨(dú)立平行擴(kuò)增，通過熒光信號(hào)，計(jì)數(shù)陰性和陽性區(qū)室的數(shù)量，再通過Passion統(tǒng)計(jì)處理即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

數(shù)字PCR經(jīng)歷了很長(zhǎng)的發(fā)展時(shí)期，經(jīng)歷了早期數(shù)字PCR（反應(yīng)體系大于5μl）——微室數(shù)字PCR（反應(yīng)體系為33nl）——微流控?cái)?shù)字PCR（反應(yīng)體系為10pl）——微滴式數(shù)字PCR（反應(yīng)體系為1pl）等階段。

數(shù)字PCR的優(yōu)點(diǎn)在于高靈敏度、絕對(duì)定量、高特異性、最低檢測(cè)限低。缺點(diǎn)有耗材昂貴、操作較繁瑣、反應(yīng)單元的生成及轉(zhuǎn)移過程中溶液的損耗、檢測(cè)線性范圍較窄、樣本通量低及生成檢測(cè)液滴耗時(shí)較長(zhǎng)等。目前數(shù)字PCR多應(yīng)用于稀有突變分析、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化、核酸定量等方面。

測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

一代測(cè)序發(fā)展

● 1954年，Whitfield等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核糖核苷酸序列。

● 1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法，Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法進(jìn)行DNA測(cè)序，一代測(cè)序多為Sanger測(cè)序的方法。

● 80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動(dòng)測(cè)序儀。

● 90年代中期出現(xiàn)毛細(xì)管電泳技術(shù)方法。目前一代測(cè)序的方法多用毛細(xì)管電泳技術(shù)。

Sanger測(cè)序技術(shù)原理圖

 Sanger測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)也很多，DNA序列測(cè)定“金標(biāo)準(zhǔn)”，很多下一代測(cè)序的結(jié)果要用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證；讀長(zhǎng)長(zhǎng)，目前讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp；準(zhǔn)確率高，高達(dá)99.999%，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)；測(cè)序成本低，每千堿基對(duì)測(cè)序成本僅0.5美金；每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000 bp。缺點(diǎn)是檢測(cè)敏感性較低，檢測(cè)通量低。Sanger測(cè)序技術(shù)應(yīng)用廣泛，如單基因遺傳病點(diǎn)突變、 Indel檢測(cè)，NGS檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證。

下一代測(cè)序技術(shù)（NGS)

2005年，下一代測(cè)序技術(shù)（NGS)開始發(fā)展。早期測(cè)序的成本很高，測(cè)一次要10萬美金，發(fā)展到今天，進(jìn)行一次全基因組測(cè)序大約1000美金。測(cè)序技術(shù)發(fā)展的速度很快，無論是技術(shù)還是機(jī)器的更新。下一代測(cè)序技術(shù)也叫做多通量測(cè)序，它是區(qū)分于Sanger測(cè)序的一種方法。它包括全基因組測(cè)序（Genome），用于產(chǎn)前診斷；全外顯子組測(cè)序（Exome），用于發(fā)現(xiàn)、鑒定致病基因；靶向目標(biāo)基因測(cè)序（Panel），用于臨床分子診斷。

染色體芯片技術(shù)（CMA）

染色體芯片技術(shù)（CMA）也叫做基因芯片、DNA芯片（DNA chip)、DNA微陣列（DNA microarray)，它是利用核酸分子雜交原理，首先將一系列預(yù)先設(shè)計(jì)好的核酸探針（oligo or cDNA)有序地、高密度地排列在玻璃、硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。目前統(tǒng)一稱為染色體芯片分析（chromosomal microarray analysis,CMA）。在臨床使用的CMA平臺(tái)主要包括兩種類型：CGH芯片和SNP芯片。

CMA的優(yōu)點(diǎn)非常的多，能在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)到染色體的缺失（deletion）和增加（duplication）；能檢測(cè)到≥10%水平的嵌合體；分辨率高。缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜；不能檢測(cè)點(diǎn)突變和平衡易位。

目前CMA的應(yīng)用面也很廣泛，作為孤獨(dú)癥（Autism）、診斷不明原因發(fā)育遲緩（DD）、智力落后(ID)、自閉癥（ASD）的首選檢驗(yàn)項(xiàng)目。多發(fā)先天畸形(MCA)、重癥智障的診斷率，從染色體核型分析的約5%提高到35～40%！大大提高了診斷效率！另外還有臨床懷疑染色體失衡性疾病、不明原因反復(fù)流產(chǎn)、癲癇等方面的檢測(cè)。在先天性心臟病的分子診斷方面，對(duì)于綜合征型CHD，CMA的診斷效率為14.1～20.6%，對(duì)于單純性CHD，CMA的診斷效率為4.3～9.3%。

臨床分子診斷中各種測(cè)序方法

CMA臨床轉(zhuǎn)化思考

根據(jù)疾病選擇檢測(cè)方法

不同的疾病需要根據(jù)疾病特點(diǎn)選擇檢測(cè)方法。數(shù)字PCR并不能代替定量PCR，數(shù)字PCR不適合做遺傳性疾病或是感染性疾病的檢測(cè)，但是非常適合無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，因?yàn)殪`敏度非常高。目前國(guó)內(nèi)涉及感染性疾病的檢測(cè)和遺傳性疾病檢測(cè)這兩個(gè)方面比較少，市場(chǎng)前景非常廣闊。

國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品嚴(yán)重缺乏，市場(chǎng)發(fā)展空間大

目前國(guó)內(nèi)CMA數(shù)據(jù)庫及國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品嚴(yán)重缺乏。現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)數(shù)據(jù)庫大多是CMA標(biāo)本有差距的白種人，實(shí)際上每個(gè)人群CNV都是有差異。國(guó)內(nèi)CHD的數(shù)據(jù)庫也嚴(yán)重缺少，這項(xiàng)工作也急需解決。

有數(shù)據(jù)表明，自閉癥占人口的1%，先天性心臟病15萬人，5.6%的出生缺陷率，產(chǎn)前診斷等等方面，都是基因芯片技術(shù)的領(lǐng)域。目前國(guó)內(nèi)使用的是國(guó)外的芯片，價(jià)格昂貴，而且使用的數(shù)據(jù)也是國(guó)外的數(shù)據(jù)，和國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)也是有差異的，因此，CMA發(fā)展空間巨大，市場(chǎng)利潤(rùn)也很豐厚�？梢哉f，染色體芯片技術(shù)還有很長(zhǎng)的路要走，不管是數(shù)據(jù)庫還是國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品，都是亟待解決的事情。目前國(guó)內(nèi)也在開發(fā)適合中國(guó)兒童出生缺陷的基因芯片，希望在不久將來可以投入到國(guó)內(nèi)的市場(chǎng)使用。