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數(shù)字PCR是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，借助微液滴或微坑，通過(guò)單個(gè)模板分子的PCR擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本的準(zhǔn)確、絕對(duì)定量。數(shù)字PCR使得反應(yīng)更靈敏、結(jié)果更可靠、展示更直觀，尤其適用于微量或痕量DNA檢測(cè)與定量。下面我們就目前已經(jīng)比較明確的數(shù)字PCR應(yīng)用方向做個(gè)介紹。

基因表達(dá)差異研究

數(shù)字PCR可以提供比實(shí)時(shí)熒光定量PCR更精確的基因差異表達(dá)研究，尤其對(duì)于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況，如：mRNA、microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析；等位基因的不平衡表達(dá)；單細(xì)胞基因表達(dá)分析；外泌體核酸分子定量分析等。

拷貝數(shù)變異(CNV)研究

數(shù)字PCR直接讀取陽(yáng)性信號(hào)，通過(guò)泊松分布校正得到目標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了絕對(duì)的檢測(cè)精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對(duì)二代測(cè)序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有檢測(cè)周期短、成本低、樣本通量高等特點(diǎn)。

低豐度DNA模板分子的精確定量

由于絕大部分微液滴中只含單個(gè)或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴(kuò)增不受高豐度模板分子擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)抑制：與此同時(shí)，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過(guò)程中進(jìn)行了相對(duì)稀釋，作用于單個(gè)微液滴內(nèi)模板擴(kuò)增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴(kuò)增對(duì)抑制劑的耐受程度，因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標(biāo)記物的檢測(cè)。一般而言，定量PCR的檢測(cè)靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達(dá)到1%，而數(shù)字PCR的檢測(cè)下限可輕松實(shí)現(xiàn)0.01%。

甲基化含量鑒定

傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測(cè)序法、抗體檢測(cè)法、定量PCR檢測(cè)法等受限于方法學(xué)的問(wèn)題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)對(duì)樣品的微液滴處理及目標(biāo)分子的絕對(duì)拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測(cè)提供了一種可靠的技術(shù)。

二代測(cè)序輔助建庫(kù)

目前靶向測(cè)序建庫(kù)方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時(shí)，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。

CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證

CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但精確定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。

腫瘤治療的伴隨診斷

常用體液來(lái)源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。

腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控

已有數(shù)篇文章報(bào)道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)患者治療過(guò)程中的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會(huì)提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，使患者得到更有效的治療。

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查

唐氏綜合征、地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)等，目前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源主要為孕婦血液，檢測(cè)胎兒DNA會(huì)受到母體DNA的干擾，依靠數(shù)字PCR可提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。對(duì)比NGS，數(shù)字PCR技術(shù)可以提高工作效率、降低檢測(cè)成本。

微生物（病毒、細(xì)菌等）的檢測(cè)

疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗(yàn)檢疫局系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室可以將基于TaqMan探針?lè)ǖ亩�量PCR體系無(wú)縫地轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實(shí)驗(yàn)室對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量結(jié)果。

其他應(yīng)用

數(shù)字PCR還可以用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)、移植排斥監(jiān)控、腸道菌群分析以及藥物基因組檢測(cè)等領(lǐng)域。

隨著數(shù)字PCR熒光通道的增加和多指標(biāo)檢測(cè)的成熟，數(shù)字PCR將會(huì)進(jìn)入更多應(yīng)用領(lǐng)域，有力推動(dòng)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。