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經(jīng)歷30年沉浮，基因療法已經(jīng)成為很多疑難雜癥的解決方案之一.

1基因療法的歷史

在四十五年前，基因療法界的領(lǐng)軍人物Theodore Friedmann博士曾設(shè)想過通過基因治療來改善由單個基因引起的遺傳性疾病�；�因治療可能具有治療更方便、效果更持久的臨床益處。與那些旨在提供某類蛋白質(zhì)的療法相比，對患者體內(nèi)的細胞進行基因療法處理，讓其持續(xù)自動制造這些所需蛋白，就能避免患者重復(fù)輸注藥物的需要。比如說，對造血干細胞（HSC）進行基因工程改造讓其制造內(nèi)源性的凝血因子，從理論上說能持續(xù)緩解血友病癥狀，而不需使用酶或輸血治療。

在最初，基因治療是被設(shè)計用來治療先天性的遺傳疾病，但近年來的科學(xué)發(fā)展讓基因治療在后天獲得的疾病領(lǐng)域也有用武之地。近期最好的例子是用基因工程改造，治療癌癥的CAR-T細胞，只需一劑，就能在患者體內(nèi)產(chǎn)生持久的反應(yīng)，長期殺滅癌細胞。

基因療法從概念轉(zhuǎn)化為臨床試驗是在20世紀(jì)90年代初期，但第一代基因療法的結(jié)果總是讓人處于從希望到失望的循環(huán)，結(jié)果顯示，那些基因療法要么缺乏實際的臨床益處，要么會產(chǎn)生意外的副作用，有時候甚至導(dǎo)致接受治療的患者死亡。在1996年，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的顧問委員會對這些試驗進行了評估，他們認(rèn)為這些試驗的結(jié)果令人失望，是因為科學(xué)界當(dāng)時對病毒載體、目標(biāo)細胞和組織以及疾病的認(rèn)識還不足。于是，該委員會建議研究者重返實驗室，對基因療法繼續(xù)進行鉆研。

之后，研究者發(fā)現(xiàn)了新的載體，對目標(biāo)細胞也有了更深入的理解，從而引發(fā)了在20世紀(jì)90年代末期和21世紀(jì)初期出現(xiàn)的第二代基因療法的臨床試驗風(fēng)潮。這些試驗顯示，基因療法能在目標(biāo)組織中造成持續(xù)的修改效果，甚至在一些試驗中展露臨床益處。但是，高效能的轉(zhuǎn)基因也導(dǎo)致了高毒性的副作用，比如有插入導(dǎo)致的遺傳毒性，破壞免疫細胞、以及與載體有關(guān)的免疫反應(yīng)等等。于是，基因治療仍待進一步完善。

在最近的十來年里，有關(guān)基因治療的研究進一步深化，對療法安全性的改進和對基因轉(zhuǎn)移效率的改善等等，讓基因療法有了巨大的臨床進展。在美國和世界各地，已有幾種基因療法和基于基因編輯的療法獲得了FDA批準(zhǔn)，另外還有多種基因療法獲得了FDA頒布的“突破性療法”的稱號。下面將著重討論這些成功的療法，以及有望在近期轉(zhuǎn)化為基因治療的相關(guān)技術(shù)。

2基因工程技術(shù)：從病毒載體到基因組編輯

基因療法所涉及的基因工程技術(shù)主要有三種，包括病毒載體、基因編輯和細胞改造。其一是將正確的基因通過載體送入目標(biāo)細胞讓其發(fā)揮作用；其二是直接通過基因編輯技術(shù)修復(fù)目標(biāo)細胞的缺陷基因；其三則是從患者體內(nèi)提取細胞在體外進行修改，然后再重新輸回患者體內(nèi)發(fā)揮作用。它們各有優(yōu)劣，適用范圍和操作難度也各不相同。

3病毒載體技術(shù)

對于第一種技術(shù)，研究者用來傳遞基因的載體多是病毒類載體，因為它們能將基因整合進宿主基因組。經(jīng)過基因改造后，這些作為載體的病毒具有復(fù)制缺陷，無法增殖，達到能將基因轉(zhuǎn)移到人體細胞的基因組中而無毒性的效果。目前最具臨床潛力的是逆轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses）載體和腺相關(guān)病毒（adeno-associated viruses，簡稱AAV）載體。

在20世紀(jì)80-90年代開發(fā)出的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（γ-retroviral vectors）是首個被證明能將基因傳遞給能重新生長的HSC的載體。它和C型逆轉(zhuǎn)錄病毒（C-type retroviruses）曾被用于第一代基因治療臨床試驗，旨在將缺陷基因的正�？截悅鬟f到患者的HSC或T細胞中。后來研發(fā)的慢病毒（lentiviruses）載體和泡沫病毒（spumaviruses）載體將這類技術(shù)應(yīng)用范圍進一步擴大：慢病毒載體能把基因轉(zhuǎn)移到非分裂期細胞中，而不影響處于G0的細胞，它還可以攜帶更大、更復(fù)雜的基因盒。慢病毒和泡沫病毒載體的另一個優(yōu)點是它們會優(yōu)先整合進基因的編碼區(qū)域，而不像γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣，會整合進入基因的5'非翻譯區(qū)，從而降低在HSC中致癌的潛在風(fēng)險。 因此，慢病毒載體是目前大多數(shù)HSC編輯的首選工具，但是γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體仍然在一些T細胞基因工程和某些基因療法中有用武之地。

AAV載體則是從非致病、無病毒包膜、天然具有復(fù)制缺陷的細小病毒（parvovirus）發(fā)展而來。野生型AAV需要另一個病毒如腺病毒（adenovirus）或皰疹病毒（herpevirus）的幫助進行復(fù)制。在基因療法中，AAV的所有病毒編碼序列都被想要表達的基因盒所取代，從而不會造成病毒感染。 AAV載體的一個限制是不能容納超過5.0kb的DNA，相比之下，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體最多可以容納8kb。 而且，AAV載體主要是非整合性的，它們轉(zhuǎn)移的DNA會作為穩(wěn)定的附加體（episome）存在，這能減少與整合進宿主基因相關(guān)的風(fēng)險，但也限制了它們在有絲分裂后細胞中的長期效果。在20世紀(jì)90年代，有試驗顯示了AAV載體在動物各種目標(biāo)組織中進行基因傳遞的能力，其中包括肝臟、視網(wǎng)膜、心肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。臨床試驗測試了AAV載體在肌肉注射和靜脈注射給藥時的效果，結(jié)果顯示，利用AAV載體遞送的轉(zhuǎn)基因在合適的情況下（比如短期用免疫抑制藥物）能在接受者體內(nèi)長期存在，遞送到視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的轉(zhuǎn)基因效果能長達三年。這些進展為將基因遞送至大腦和肌肉奠下了基石。雖然AAV的安全性較佳，但其療效受到劑量限制以及對AAV的免疫反應(yīng)影響。

4基因編輯技術(shù)

與只能添加基因的病毒載體相比，基因編輯技術(shù)可以達到添加基因、消除基因、矯正基因以及其他多種基因組編輯的效果�；�因編輯既可以在體外細胞進行，也可以將基因編輯工具遞送到體內(nèi)進行原位基因組編輯。要對于目標(biāo)基因進行編輯，第一步是進行受核酸酶（nucleus）介導(dǎo)的雙鏈斷裂，引發(fā)細胞中的DNA重組和修復(fù)。非同源末端鏈接（NHEJ）性質(zhì)的重組能夠有效地插入、刪除或滅活某基因。而同源導(dǎo)向修復(fù)（HDR）則能在有正確的DNA模板存在的情況下，用于制造正確的對應(yīng)序列，達到修復(fù)基因的目的。早期的基因編輯手段依賴于特異性鋅指核酸酶（ZFNs）或者大范圍核酸酶（meganucleases），對于每個待編輯的目標(biāo)DNA區(qū)域都要重新設(shè)計特定序列，在可操作性和易用性上不盡如人意而限制了普及性。在2009年，基于名為TALEs細菌的蛋白開發(fā)出的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（TALENs），能有效切割DNA的任何目標(biāo)序列，讓基因編輯技術(shù)大步前進，但這項技術(shù)仍然需要對每個DNA目標(biāo)序列設(shè)計特定的核酸酶，因而有一定的局限性。

到了2012年，研究者發(fā)現(xiàn)了一種細菌防御機制，包括規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（CRISPR）及相關(guān)核酸內(nèi)切酶（Cas）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在有引導(dǎo)RNA（gRNA）的存在下，能方便準(zhǔn)確地切割DNA，這導(dǎo)致了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)橫空出世，并被迅速應(yīng)用到各類真核動物細胞，大大簡化了基因編輯的工作量并且降低了花費。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以增添、敲除、開啟或關(guān)閉基因，對任何哺乳動物細胞的基因進行替換和改造，從而改善缺陷基因的功能或者遏制致病基因，甚至能通過敲除細胞表面蛋白達到阻礙病毒入侵人體細胞的目的，或者通過編輯免疫細胞為器官移植患者降低免疫排斥反應(yīng)等等，在諸多疾病治療領(lǐng)域大有可為。目前研究者正在改善該技術(shù)的脫靶效應(yīng)和安全性，以便讓其為更廣大的患者帶來福音。

跟病毒載體相比，基因編輯技術(shù)能較精確地編輯基因組，克服病毒載體插入位置較隨機的問題，從而避免隨機整合可能帶來的原癌基因激活和抑癌基因失活等副作用，并且，通過基因編輯引入的基因能受到目標(biāo)組織內(nèi)源性啟動子的控制，讓基因表達更具生理相關(guān)性。但是，將基因編輯所需的全部組件遞送至目標(biāo)組織細胞內(nèi)仍有一定難度。如果只需要NHEJ編輯，那么用非整合性病毒載體即可達到目的，但如果需要進行有DNA模板的HDR編輯，那么目前的技術(shù)仍需要優(yōu)化，才有望在一些特定細胞中達到可接受的效果。

5細胞工程

近年來在癌癥研究學(xué)界聲名鵲起的免疫療法，其中之一就是基于工程化T細胞的CAR-T基因療法。CAR-T中的CAR是指工程化的嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor），由一個來自免疫球蛋白分子或T細胞受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和介導(dǎo)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域融合，從而激活和增強T細胞的功能和持久性。CAR-T 治療首先要從患者體內(nèi)分離T細胞，在體外將工程化的CARs傳送到T細胞中，產(chǎn)生抗原特異性的T細胞，讓其能識別和殺滅癌細胞，經(jīng)由體外擴增后再次注入患者體內(nèi)，以此達到消滅癌細胞的效果。理論上，CAR-T可以達到一勞永逸的治愈效果。在2017年一年內(nèi)，美國FDA就批準(zhǔn)了2個CAR-T療法，用于治療難治性急性淋巴性白血�。ˋLL）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）。目前在這領(lǐng)域的研究旨在加快患者個體化CAR-T的制備過程，擴大CAR-T的適用范圍到骨髓瘤和實體瘤，以及降低治療時的危險性和副作用。

CAR-T療法能針對的不僅僅是癌癥。與生理存在的抗原受體相比，CARs可被設(shè)計來識別蛋白質(zhì)、碳水化合物糖脂以及HLA-肽復(fù)合物等等，所以在將來還有潛力治療以T細胞為基礎(chǔ)的其他疾病，比如自身免疫性疾病和艾滋病等等。

6總結(jié)

基因療法可算是有史以來最復(fù)雜和多樣化的藥物療法。從研究性學(xué)術(shù)環(huán)境中起步，通過與生物技術(shù)公司和制藥企業(yè)的合作轉(zhuǎn)變?yōu)楣�業(yè)化的藥物開發(fā)途徑。近年間，基因編輯技術(shù)基礎(chǔ)理論方面的進展、多個臨床試驗的成熟結(jié)果以及監(jiān)管方的批準(zhǔn)，顯示了基因治療進入了一個兼具安全性和有效性的時代。但這個領(lǐng)域中仍然存有許多挑戰(zhàn)，包括處理整合性基因載體的遺傳毒性，降低基因編輯的脫靶效應(yīng)，和提高基因遞送和編輯的效率，讓其達到有臨床益處的水平等等。種種結(jié)果顯示，基因療法的潛力極大，有望在不遠的將來解決一些至今讓醫(yī)療界素手無策的頑疾，為人類健康帶來持久的益處。