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        肺癌是全球排名第一位的腫瘤殺手。與30年前相比，我國肺癌死亡率上升了465%，發(fā)病率高居榜首。肺癌通常分為非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）。其中NSCLC占了肺癌的85%。

        隨著腫瘤分子生物學(xué)的進展，臨床上對NSCLC的認(rèn)識正不斷深入。研究表明，50% NSCLC的發(fā)生是由于一系列的驅(qū)動基因，包括EGFR，KRAS，ALK，MEK，PI3K，BRAF等。找到驅(qū)動基因，再進行針對性用藥，NSCLC治療就能事半功倍。研究人員發(fā)現(xiàn)，胰島素受體家族的成員——間變性淋巴瘤激酶（ALK）是NSCLC的關(guān)鍵啟動癌基因。在NSCLC患者中，雖然只有5%的患者會出現(xiàn)ALK基因重排，但是中國每年新發(fā)病例數(shù)仍接近35,000例。由于ALK陽性NSCLC具有明確的分子靶點、靶點檢測技術(shù)以及上市的靶向藥物，通過準(zhǔn)確診斷ALK基因重排，ALK陽性患者可從酪氨酸激酶抑制劑（克唑替尼）治療中獲益，明顯提高臨床療效。

        從組織學(xué)分型上，還有肺腺癌和肺鱗癌之分。由美國病理協(xié)會、國際肺癌研究協(xié)會、分子病理協(xié)會出臺的《肺癌分子標(biāo)志物檢測指南2013》明確指出：所有含有腺癌成分的NSCLC均需檢測ALK。今年6月，由中國臨床腫瘤學(xué)會腫瘤生物標(biāo)志物專家委員會出臺的《中國間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識（2013版）》（簡稱《共識》）指出：對于潛在懷疑存在ALK基因融合變異的患者均可進行ALK融合基因檢測。

    在第七屆中國病理醫(yī)師年會期間，羅氏診斷舉辦了"ALK在NSCLC中的診斷與經(jīng)驗分享"衛(wèi)星會，全國知名病理專家就ALK檢測方法、最新標(biāo)準(zhǔn)化的ALK免疫組化檢測判讀指南等內(nèi)容進行了探討。 

ALK融合基因的檢測方法

        根據(jù)《共識》，熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization, FISH）、基于PCR擴增基礎(chǔ)上的技術(shù)和免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry, IHC）均可作為針對ALK融合基因檢測常用的方法，實驗室可以根據(jù)組織標(biāo)本類型選擇合適的檢測技術(shù)。

        由于大部分克唑替尼治療ALK陽性NSCLC的臨床試驗均是基于FISH的診斷，因此，F(xiàn)ISH檢測目前仍是確定ALK融合基因的參考標(biāo)準(zhǔn)方法。但是，由于FISH檢測對于操作和判讀技術(shù)的要求很高，只有FISH操作經(jīng)驗豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有可靠性；而且晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活檢組織，因此很難保證每個視野存在50個以上的癌細(xì)胞供結(jié)果判讀；而且暗視野下無法獲得完整的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。FISH檢測結(jié)果要求≥15%的判斷界值（cut off）也存在商榷之處，研究結(jié)果顯示少數(shù)ALK FISH檢測陰性、IHC檢測陽性的患者也能從靶向藥物中獲益。同時，目前FISH檢測的成本昂貴，且不能明確ALK融合基因的具體融合變體。因此，在現(xiàn)階段，F(xiàn)ISH檢測尚無法適用于中國ALK陽性NSCLC患者的大規(guī)模篩查和診斷。

        基于PCR擴增基礎(chǔ)上的RT-PCR法檢測ALK融合基因的特點在于快速、簡便易行，能同時明確ALK基因已知的融合變體的類型。但是，該方法對于RNA提取的質(zhì)量要求較高，國內(nèi)部分實驗室未具備嚴(yán)格的質(zhì)量控制條件。此外，無法檢測未知的融合型是其最大的不足之處，限制了其在ALK診斷中的應(yīng)用。 

        早期的ALK融合蛋白的IHC抗體敏感性較低，因此不適宜用于ALK融合蛋白的檢測。隨著技術(shù)的改進， 羅氏診斷VENTANA ALK IHC檢測特異性的提高了檢測靈敏度，同時采用全自動化操作，使檢驗流程和結(jié)果判讀都得以標(biāo)準(zhǔn)化，可實現(xiàn)與FISH結(jié)果高度一致性，結(jié)果判讀的可重復(fù)性為99.7%，為ALK檢測的臨床廣泛應(yīng)用帶來了巨大的突破。  

首款全自動IHC檢測獲認(rèn)可        

         VENTANA ALK IHC檢測是唯一獲得歐盟認(rèn)證的用于識別適合克唑替尼治療的患者的體外診斷IHC檢測，已在全球超過53個國家銷售。日前，該檢測獲得了中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)在華上市。該項批準(zhǔn)基于一項囊括了北京腫瘤醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的1,100個中國患者的回顧性研究，證明了VENTANA ALK IHC檢測與雅培Vysis ALK Break Apart FISH 探針試劑盒的一致性達(dá)99.23%。

        VENTANA ALK IHC技術(shù)平臺方法使用了基于非內(nèi)源性半抗原、信號擴增多聚體和辣根過氧化物酶系統(tǒng)的染色信號放大技術(shù)。在不影響檢測特異性的前提下，提高了敏感性。結(jié)果判讀時采用二分類系統(tǒng)，即僅為陽性和陰性兩種，陽性結(jié)果即可診斷為ALK陽性NSCLC。

        來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的免疫組化病例證實，VENTANA ALK IHC檢測具有獨特優(yōu)勢。判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單；敏感性高，均為強陽性顆粒，不用判斷強度和百分比；全自動檢測有效避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好；可檢測FFPE的細(xì)胞學(xué)樣本、細(xì)針穿刺、支氣管活檢以及大體樣品, 沒有最低細(xì)胞數(shù)要求。最重要的是，價格便宜，可同時用于ALK的篩選和診斷。

        在進行VENTANA ALK IHC檢測時，建議檢測人員使用10%的中性福爾馬林和鋅福爾馬林固定后，用石蠟包埋組織樣品，時間應(yīng)不少于6小時，但不要超過24個小時；為了避免嚴(yán)重影響染色結(jié)果，應(yīng)避免使用AFA、B5、Bouin’s或95%酒精固定。建議使用保存不超過3個月、厚度約為4微米的切片，使用正電荷載玻片。 

 ALK陽性NSCLC診斷流程

        鑒于ALK基因重排或融合的分子診斷各種方法均有優(yōu)缺點，且我國適用于ALK變異檢測的肺癌患者人數(shù)眾多，《共識》中提出一套行之有效的分子診斷流程（見圖3），并認(rèn)為IHC具有方便、易行、價格低的優(yōu)勢，適合于ALK陽性NSCLC的篩查。FISH和RT-PCR由于結(jié)果判讀客觀，且qRT-PCR已獲CFDA批準(zhǔn)用于臨床檢測，適合于最終的確診。

       《共識》專家組推薦ALK基因狀態(tài)檢測的總體原則：應(yīng)綜合肺癌獲取的各類生物材料的特征、分子檢測方法的特點、實驗室自身條件，進行多學(xué)科大協(xié)作，合理采取有效檢測方法和流程，以保證ALK陽性肺癌的檢出率和準(zhǔn)確率。

注：（1）a：建議優(yōu)先在以下臨床病理特征集中的患者標(biāo)本中進行篩選：粘液型腺癌、含印戒細(xì)胞成分、不吸煙、年齡<60歲，但這些特征并非排他性的，即對其他疑有ALK融合變異患者均可進行檢測；（2）b：對于部分無條件行VENTANA IHC檢測的醫(yī)療機構(gòu)或中心，常規(guī)ALK IHC可作為替代篩選方法，但陽性標(biāo)本需以FISH、VENTANA IHC或序列特異性的PCR技術(shù)進一步確診（3）ALK抗體使用推薦：VENTANA IHC使用專用抗體試劑盒（D5F3）；（4）流程圖中FISH、RT-PCR、VENTANA IHC技術(shù)之間的虛線表示：單一技術(shù)檢測結(jié)果判斷不確定時3種方法之間可相互驗證結(jié)果；（5）c：序列特異性的PCR技術(shù)診斷ALK融合基因條件：PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后序列比對確認(rèn)或基于特異性熒光探針的即時定量PCR檢測融合變異，單純RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后的條帶觀察不推薦作為ALK融合基因診斷依據(jù)；（6）請參考2013年度美國病理學(xué)家學(xué)會（CAP）、國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）、分子病理學(xué)協(xié)會（AMP）聯(lián)合發(fā)布的《肺癌患者使用靶向藥物的分子檢測指南》。

        NSCLC的分子靶向治療將越來越依賴于分子靶點變異的分子診斷。臨床實踐中分子檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和標(biāo)準(zhǔn)流程的建立對于"提高臨床實踐能力"起到關(guān)鍵作用。ALK基因融合變異作為晚期肺癌中的第二個明確應(yīng)用的分子分型，其診斷方法和流程仍需進一步結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進行優(yōu)化。