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為加強(qiáng)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑的規(guī)范和指導(dǎo)，進(jìn)一步保證和提高相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，8月8日，中國食品藥品檢定研究院（中檢院）組織制定了《第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則》（下稱《指導(dǎo)原則》）。
該文件是中檢院發(fā)布的首個(gè)質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則，旨在對(duì)產(chǎn)品設(shè)計(jì)、研發(fā)及驗(yàn)證的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行規(guī)范，從而有效地保證產(chǎn)品質(zhì)量。此次發(fā)布的通用技術(shù)指導(dǎo)原則對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提出指導(dǎo)性意見，廣泛適用于各類第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑，有利于行業(yè)發(fā)展。
基本原則：NGS相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得醫(yī)療器械許可證
《指導(dǎo)原則》強(qiáng)調(diào)，NGS檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量管理體系應(yīng)符合《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》的要求，并應(yīng)通過《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則》的核查。
試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境。建立專用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過程中樣本之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測(cè)的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施
生物信息學(xué)分析應(yīng)報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果
《指導(dǎo)原則》對(duì)數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)分析進(jìn)行了指導(dǎo)。數(shù)據(jù)庫（參考序列）用于NGS檢測(cè)試劑的生物信息學(xué)分析，輔助測(cè)序比對(duì)拼接和測(cè)序結(jié)果確認(rèn)。建議企業(yè)提交數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫類型（本地?cái)?shù)據(jù)庫、在線數(shù)據(jù)庫）、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及升級(jí)方案等資料。用于對(duì)原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并報(bào)告最終檢測(cè)結(jié)果。建議企業(yè)提交分析軟件的版本、算法、性能驗(yàn)證以及升級(jí)方案等資料。
企業(yè)應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。企業(yè)應(yīng)建立生物信息學(xué)分析流程標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析應(yīng)報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。
除了以上信息，《指導(dǎo)原則》還對(duì)檢測(cè)流程、檢測(cè)試劑原材料和數(shù)據(jù)分析原材料等進(jìn)行了指導(dǎo)。
指導(dǎo)原則全文：（微信省略，寫點(diǎn)擊閱讀原文瀏覽）
《第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則》
一、 前言
本指導(dǎo)原則主要針對(duì)第二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)檢測(cè)試劑（以下簡稱"NGS檢測(cè)試劑"）產(chǎn)品質(zhì)量提出指導(dǎo)性要求，涉及基本原則、主要原材料、檢測(cè)流程及性能評(píng)價(jià)等方面。
本指導(dǎo)原則是對(duì)企業(yè)和檢驗(yàn)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。
二、 適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于基于NGS技術(shù)的檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。NGS檢測(cè)試劑的預(yù)期用途包括但不限于以下內(nèi)容：腫瘤相關(guān)基因異常、遺傳疾病相關(guān)基因異常、胚胎植入前染色體非整倍體、胎兒染色體非整倍體及病原微生物等臨床檢測(cè)應(yīng)用。此類檢測(cè)試劑涉及的NGS技術(shù)包括靶向性測(cè)序和非靶向性測(cè)序：靶向性測(cè)序法是指對(duì)樣本中的基因組進(jìn)行部分測(cè)序，如靶基因測(cè)序、外顯子（組）測(cè)序等；非靶向性測(cè)序是指對(duì)樣本中潛在生物體的基因組進(jìn)行測(cè)序。原則上不建議企業(yè)應(yīng)用全基因組測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)，如果企業(yè)應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)，應(yīng)進(jìn)行充分的技術(shù)適用性驗(yàn)證并提交報(bào)告。
待測(cè)樣本可以是人源樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等），檢測(cè)對(duì)象可以是脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或兩者的混合物。
本指導(dǎo)原則盡可能覆蓋所有的NGS技術(shù)原理和測(cè)序平臺(tái)，所討論和描述的內(nèi)容不限于某個(gè)特定的NGS檢測(cè)試劑。但鑒于NGS技術(shù)一直在不斷升級(jí)和更新，可能會(huì)有本指導(dǎo)原則未能涉及的新技術(shù)。
三、 基本要求
（一） 基本原則
1. NGS檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。
2. 試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量管理體系應(yīng)符合《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》的要求，并應(yīng)通過《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場(chǎng)檢查指導(dǎo)原則》的核查。
3. 試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境。建立專用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過程中樣本之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測(cè)的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施。
（二） 主要原材料
NGS檢測(cè)試劑的主要原材料包括實(shí)驗(yàn)原材料和數(shù)據(jù)分析原材料。實(shí)驗(yàn)原材料包括引物、探針、酶、參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等，企業(yè)應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等；數(shù)據(jù)分析原材料包括數(shù)據(jù)庫（參考序列）、生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存中心等。數(shù)據(jù)分析原材料能影響檢測(cè)結(jié)果，企業(yè)應(yīng)提供盡量完整的研究資料，如數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源性、生物信息學(xué)分析軟件的算法以及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存中心的安全性與穩(wěn)定性等。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)原材料，若企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；若來自市場(chǎng)（從其他單位購買），應(yīng)提供的資料包括：對(duì)供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購買合同、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。原材料或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)，并重新對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證。
對(duì)于數(shù)據(jù)分析原材料，若企業(yè)自己提供，應(yīng)具有完整的生物信息學(xué)分析軟、硬件能力，制定相應(yīng)的開發(fā)、維護(hù)及升級(jí)等方案；若來自市場(chǎng)（購買服務(wù)或產(chǎn)品），應(yīng)提供相應(yīng)的驗(yàn)證資料及后續(xù)的維護(hù)、升級(jí)等方案資料。如材料發(fā)生變更，應(yīng)重新對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行性能驗(yàn)證，并依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)。
建議企業(yè)提供的詳細(xì)資料包括但不限于以下內(nèi)容：
1. 核酸提取、分離及純化組分的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料，需覆蓋產(chǎn)品檢測(cè)涉及的各樣本類型。
2. 測(cè)序文庫構(gòu)建組分的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料
構(gòu)建測(cè)序文庫的主要原料（脫氧三磷酸核苷、接頭序列、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及研究資料。如以上原材料來自市場(chǎng)，企業(yè)可提供供應(yīng)商出具的質(zhì)檢報(bào)告。如供應(yīng)商提供的原材料為混合體系，可提供針對(duì)混合體系的質(zhì)檢報(bào)告。
2.1 脫氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；建議提交對(duì)純度、濃度及保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。
2.2 引物、探針及接頭
引物、探針及接頭均是由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列。探針帶有特定的標(biāo)記物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)和捕獲。接頭包括條碼（barcode）或標(biāo)簽（index），用于將待測(cè)核酸與測(cè)序載體連接、區(qū)分不同來源的樣本等。
建議企業(yè)提交序列選擇、制備方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以及對(duì)分子量、純度、保存穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如果為外購，需提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。
2.3 連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶
連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶及限制性內(nèi)切酶應(yīng)具有相應(yīng)的酶活性。建議提交酶活性、熱穩(wěn)定性及工作效率等驗(yàn)證資料。
3. 參考品或標(biāo)準(zhǔn)品原料選擇、制備、定值過程、穩(wěn)定性研究及性能驗(yàn)證等資料。
4. 核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染，建議提交相應(yīng)檢測(cè)報(bào)告。
5. 數(shù)據(jù)庫（參考序列）
數(shù)據(jù)庫（參考序列）用于NGS檢測(cè)試劑的生物信息學(xué)分析，輔助測(cè)序比對(duì)拼接和測(cè)序結(jié)果確認(rèn)。建議企業(yè)提交數(shù)據(jù)庫（參考序列）的溯源信息、數(shù)據(jù)庫類型（本地?cái)?shù)據(jù)庫、在線數(shù)據(jù)庫）、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及升級(jí)方案等資料。
6. 生物信息學(xué)分析軟件
用于對(duì)原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并報(bào)告最終檢測(cè)結(jié)果。建議企業(yè)提交分析軟件的版本、算法、性能驗(yàn)證以及升級(jí)方案等資料。
7. 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心
用于儲(chǔ)存原始和經(jīng)過分析后的檢測(cè)結(jié)果，可以是本地或云儲(chǔ)存中心。建議企業(yè)提交數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級(jí)方案以及異常情況處置方案等資料。
（三） 檢測(cè)流程
NGS檢測(cè)試劑的檢測(cè)流程可以分為樣本收集、樣本制備、測(cè)序、生物信息學(xué)分析及報(bào)告和數(shù)據(jù)庫管理等五個(gè)環(huán)節(jié)。企業(yè)在設(shè)計(jì)開發(fā)過程中應(yīng)充分考慮每個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，并進(jìn)行驗(yàn)證。
1. 樣本收集
樣本可以為人體樣本（如體液、組織、排泄物等）或病原微生物分離培養(yǎng)物（如血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等）。樣本的獲取及預(yù)處理方式、保存條件及期限（短期、長期）、運(yùn)輸條件等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并引用；若沒有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則企業(yè)應(yīng)該設(shè)立自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，以保證樣本的質(zhì)量，并且防止樣本間的混淆與交叉污染。不同類型的樣本所抽提的核酸的質(zhì)量可能有所差異，對(duì)于每一種類型的樣本，應(yīng)當(dāng)明確檢測(cè)所需樣本的用量。如樣本不符合要求，應(yīng)重新取樣。
企業(yè)需明確標(biāo)識(shí)出以下內(nèi)容，包括產(chǎn)品適用的樣本類型、采集時(shí)間、采集部位、采集方式、采集量及保存和運(yùn)輸條件等內(nèi)容。樣本的采集時(shí)間的選擇需考慮是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響；采集部位應(yīng)考慮樣本的代表性、操作的難易程度及安全性等因素；采集方式應(yīng)詳述具體的操作方法或列出相關(guān)操作指南文件以指導(dǎo)使用者（含圖示）；企業(yè)根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，設(shè)計(jì)具體的采集量標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)應(yīng)明確采集量判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法；保存和運(yùn)輸條件應(yīng)保護(hù)樣本中的核酸，企業(yè)應(yīng)明確樣本的保存條件（溫度、濕度等）及期限（短期、長期）、運(yùn)輸條件（溫度、濕度等）及反復(fù)凍融限制等。
2. 樣本制備
2.1 核酸提取、分離及純化
樣本中核酸的提取、分離及純化的主要目的是為了富集核酸濃度并保證核酸序列的完整性。企業(yè)應(yīng)在NGS檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開發(fā)過程中對(duì)配套使用的核酸提取、分離及純化試劑進(jìn)行匹配性驗(yàn)證，以確保其性能滿足檢驗(yàn)的需要。企業(yè)應(yīng)明確檢測(cè)所需核酸的最小用量。
企業(yè)應(yīng)該設(shè)立核酸抽提及抽提后質(zhì)量控制的書面標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并依據(jù)性能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸溶液濃度范圍要求，以保證核酸樣本的質(zhì)量與濃度符合要求，并且防止樣本間的混淆與交叉污染。企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)抽提的每一次核酸樣本的各種質(zhì)控參數(shù)有詳細(xì)的記錄，建議包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)方法包括但不限于分光光度法、熒光法等；核酸完整性檢測(cè)方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。如果提取、分離及純化的核酸樣本質(zhì)量不符合要求，應(yīng)重新取樣或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。
2.2 靶向序列富集及測(cè)序文庫構(gòu)建
靶向序列富集是指靶向性擴(kuò)增一定大小的核酸片段，企業(yè)應(yīng)對(duì)富集原理及方法進(jìn)行詳細(xì)描述。企業(yè)應(yīng)制定標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，記錄包括靶向序列片段的濃度、純度及大小等參數(shù)。
企業(yè)根據(jù)具體的測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，對(duì)核酸序列進(jìn)行片段化處理，片段的長短應(yīng)符合后續(xù)測(cè)序的要求，片段化方法包括但不限于超聲法、酶切法等。企業(yè)應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案，對(duì)經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度、純度及大小等參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并詳細(xì)記錄。
2.3 添加接頭（條碼或標(biāo)簽）
測(cè)序文庫中的短核酸片段需要與測(cè)序載體連接后才能進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，這一連接過程需要先給短核酸片段添加接頭。NGS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)將多個(gè)來源不同的樣本混合后在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中同步檢測(cè)，為了區(qū)分這些樣本，通常采用在每一個(gè)原始樣本的測(cè)序文庫中加上唯一的寡核苷酸標(biāo)簽的方法進(jìn)行標(biāo)記，這些寡核苷酸標(biāo)簽被稱為條碼或標(biāo)簽。條碼和標(biāo)簽可以包含于接頭序列內(nèi)，也可以獨(dú)立于接頭序列。
添加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過程添加。企業(yè)使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充分驗(yàn)證并滿足測(cè)序所需的質(zhì)量要求，如測(cè)序深度、覆蓋度等條件。同時(shí)，企業(yè)應(yīng)對(duì)潛在的問題進(jìn)行充分研究，包括但不限于：條碼檢出率的均勻性、條碼互換比率以及條碼間相互污染或干擾等因素。企業(yè)應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對(duì)每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。
3. 測(cè)序
3.1 測(cè)序平臺(tái)
目前商業(yè)上常用的第二代測(cè)序平臺(tái)根據(jù)測(cè)序原理可分為光學(xué)技術(shù) (Illumina公司、華大基因公司為代表）和半導(dǎo)體技術(shù)（Thermo公司為代表）。每個(gè)測(cè)序平臺(tái)都有各自的特異性參數(shù)，包括儀器大小、通量、讀長、運(yùn)行時(shí)間及測(cè)序成本等，企業(yè)應(yīng)結(jié)合具體的臨床應(yīng)用需求選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。
3.2 測(cè)序及堿基讀取
企業(yè)應(yīng)根據(jù)所選用的測(cè)序平臺(tái)，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。企業(yè)應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測(cè)序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測(cè)序所需要的覆蓋度及深度。在測(cè)序過程中，企業(yè)應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測(cè)序過程當(dāng)中的測(cè)序質(zhì)量。企業(yè)應(yīng)根據(jù)具體的預(yù)期用途，制定產(chǎn)品的測(cè)序覆蓋度和深度，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。
堿基讀取是指識(shí)別一段基因序列片段每一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的過程。不同測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序偏好性，可影響堿基讀取過程中的錯(cuò)誤類型與比率。應(yīng)用軟件可以消除或部分抵消測(cè)序偏好性的影響，提高堿基讀取的準(zhǔn)確性。堿基讀取后，企業(yè)應(yīng)對(duì)每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。若堿基讀取質(zhì)量有通用標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)遵循并引用；若沒有通用標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體應(yīng)用情況制定堿基讀取質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及分析方法，并提供充分的理論依據(jù)及驗(yàn)證結(jié)果。
4. 生物信息學(xué)分析及報(bào)告
企業(yè)應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。企業(yè)應(yīng)建立生物信息學(xué)分析流程標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析應(yīng)報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。
4.1 序列比對(duì)拼接
序列比對(duì)是指利用生物信息學(xué)軟件，將短的測(cè)序片段與參考序列進(jìn)行比對(duì)后完成拼接的過程。參考序列應(yīng)具有明確溯源性，可以是全基因組序列或基因片段序列。若預(yù)期用途為檢測(cè)未知病原微生物，難以提前確定參考序列，可以將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行互相比對(duì)，在此基礎(chǔ)上完成長序列的拼接。
不同的序列比對(duì)軟件的準(zhǔn)確性、特異性及比對(duì)速度等方面均有差異，企業(yè)需根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇。企業(yè)需要評(píng)估序列比對(duì)的質(zhì)量，若比對(duì)質(zhì)量有通用的標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)遵循，并引用；若沒有通用的標(biāo)準(zhǔn)，則企業(yè)應(yīng)當(dāng)設(shè)立自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)，以保證比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4.2 待測(cè)基因序列的確認(rèn)
決定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素包括但不限于測(cè)序均勻度、覆蓋度和測(cè)序深度等。一般地，測(cè)序均勻度越好，覆蓋度越廣，深度越深，待測(cè)基因序列的拼接結(jié)果越準(zhǔn)確。待測(cè)基因序列中某些特殊區(qū)域的測(cè)序深度可能很低，可據(jù)此設(shè)置產(chǎn)品的最低檢出限。企業(yè)需要對(duì)樣本測(cè)序結(jié)果各個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序覆蓋度和深度有明確的計(jì)算方法和詳細(xì)的描述。
4.3 文件格式
生物信息學(xué)分析結(jié)果的輸出格式有很多種，但是無論何種格式的文件必須包含文件結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)組織形式的說明，以及其它格式文件和生物信息學(xué)分析軟件的兼容性說明。建議使用通用的文件格式，如比對(duì)結(jié)果使用".bam"文件或其他，測(cè)序結(jié)果使用".fastq"文件或其他。如果企業(yè)采用自己內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)格式文件，應(yīng)建立該標(biāo)準(zhǔn)格式的詳細(xì)說明，并注明該文件格式與其它格式的兼容性及相互轉(zhuǎn)換的方法。
4.4 檢測(cè)結(jié)果解讀與報(bào)告
若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，報(bào)告中應(yīng)明確報(bào)告說明書中預(yù)期用途與檢測(cè)范圍涵蓋的變異位點(diǎn)與變異類型以及相應(yīng)的遺傳注釋。建議基因名字應(yīng)當(dāng)與國際上通用的HUGO基因命名委員會(huì)命名規(guī)則(http://www.genenames.org)一致。
若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)明確測(cè)序樣本中是否含有待測(cè)病原微生物。如果是分型檢測(cè)試劑和耐藥突變檢測(cè)試劑還要明確報(bào)告病原微生物的型別及耐藥突變位點(diǎn)信息。
報(bào)告中建議包括但不限于明確的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)方法及局限性等內(nèi)容。原則上禁止報(bào)告中出現(xiàn)超出產(chǎn)品預(yù)期用途的檢測(cè)項(xiàng)目及結(jié)果。企業(yè)應(yīng)制定明確的檢測(cè)結(jié)果解讀與報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)不明確的檢測(cè)結(jié)果以及非預(yù)期檢測(cè)結(jié)果應(yīng)有詳細(xì)明確的處置方案。
5. 數(shù)據(jù)庫（參考序列）及數(shù)據(jù)儲(chǔ)存
數(shù)據(jù)庫（參考序列）的易用性、準(zhǔn)確性及全面性等因素對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的正確解讀極為重要。企業(yè)應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的具體使用情況選擇數(shù)據(jù)庫（參考序列）并明確其溯源性。無論選擇何種類型的數(shù)據(jù)庫，企業(yè)應(yīng)對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果負(fù)責(zé)。若企業(yè)使用自建的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)制定完整的維護(hù)方案（實(shí)時(shí)和定期維護(hù)方案）對(duì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)容進(jìn)行增補(bǔ)或剔除，從而確保數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性及全面性。
NGS檢測(cè)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，企業(yè)應(yīng)當(dāng)制定合適的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方案。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方式可為本地或云存儲(chǔ)，無論選擇哪種方式，企業(yè)應(yīng)充分考慮數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的時(shí)限性、安全性及穩(wěn)定性等因素。對(duì)于已儲(chǔ)存數(shù)據(jù)的重新訪問與分析，企業(yè)應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)記錄（如訪問時(shí)間，訪問人員、訪問內(nèi)容及訪問目的等信息）。對(duì)于已存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，原則上允許對(duì)其進(jìn)行基于新預(yù)期用途的重復(fù)分析，但禁止出具新的檢測(cè)報(bào)告。
（四） 性能評(píng)價(jià)
1. 核酸提取、測(cè)序文庫構(gòu)建
核酸提取的完整性和純度以及測(cè)序文庫構(gòu)建的質(zhì)量都能影響檢測(cè)結(jié)果，因此應(yīng)對(duì)上述步驟進(jìn)行質(zhì)量控制。建議的質(zhì)量控制因素包括但不限于以下各項(xiàng)：用于核酸提取的樣本質(zhì)量、體積；核酸濃度及核酸定量方法；核酸純化的質(zhì)量及檢測(cè)方法；測(cè)序文庫的核酸質(zhì)量、濃度及片段大小等。
2. 陰性、陽性參考品
2.1 預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因
陰性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品說明書中的預(yù)期用途與檢測(cè)范圍的野生型樣本，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性；
陽性參考品應(yīng)涵蓋產(chǎn)品說明書中的預(yù)期用途與檢測(cè)范圍的變異型樣本，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽性；
2.2 預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物
陰性參考品應(yīng)包括與待檢病原微生物種屬相近、臨床癥狀相似的病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性；
陽性參考品應(yīng)包括產(chǎn)品說明書中預(yù)期用途與檢測(cè)范圍待檢病原微生物，且應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽性。
3. 最低檢出限
建議可以從擴(kuò)增反應(yīng)終體系核酸濃度或基因變異序列所占百分率兩方面對(duì)最低檢出限進(jìn)行評(píng)價(jià)。NGS檢測(cè)試劑具有同時(shí)檢測(cè)多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的能力，可將多個(gè)最低檢出限參考品混合進(jìn)行檢測(cè)，但應(yīng)分別報(bào)告各個(gè)位點(diǎn)或靶點(diǎn)的最低檢出限結(jié)果。若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋所有基因變異類型；若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，最低檢出限參考品應(yīng)覆蓋所有待測(cè)病原微生物。
建議最低檢出限參考品
優(yōu)先使用臨床獲得的生物樣本（細(xì)胞系、病原微生物等）；對(duì)于某些難以獲得的樣本（如罕見基因類型、難以分離培養(yǎng)的病原微生物等），可以使用核酸模擬樣本（如假病毒、核酸片段、質(zhì)粒等）。使用病原微生物或核酸模擬樣本作為參考品時(shí)，應(yīng)混入適量（參考臨床水平）的人源基因組。
4. 精密性
對(duì)于定量檢測(cè)試劑，建議考察試劑的標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)；若為定性檢測(cè)試劑，可不進(jìn)行考察。建議從以下方面對(duì)NGS檢測(cè)試劑的精密性進(jìn)行評(píng)價(jià)：
4.1 對(duì)可能影響檢測(cè)精密性的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，還應(yīng)對(duì)第二代測(cè)序儀、操作者及地點(diǎn)等因素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證；
4.2 建議精密性評(píng)價(jià)方法考慮以下檢測(cè)因素，包括檢測(cè)周期、檢測(cè)次數(shù)、檢測(cè)方式（批內(nèi)、批間）以及檢測(cè)人員數(shù)量等；
4.3 若預(yù)期用途為檢測(cè)人源基因，用于精密性評(píng)價(jià)的參考品建議覆蓋低頻率樣本；若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，用于精密性評(píng)價(jià)的參考品建議覆蓋弱陽性樣本。
5. 干擾物質(zhì)
企業(yè)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質(zhì)，并進(jìn)行充分驗(yàn)證。驗(yàn)證干擾物質(zhì)時(shí)，建議驗(yàn)證的項(xiàng)目包括但不限于以下項(xiàng)目：
5.1 引物之間的互相干擾對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；
5.2 潛在的PCR干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；
5.3 若預(yù)期用途為檢測(cè)病原微生物，應(yīng)分別檢測(cè)目標(biāo)病原微生物存在和不存在的情況下，非目標(biāo)病原微生物（種屬相近、臨床癥狀相似）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，以及人源基因組對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
6. 其他問題
6.1 若產(chǎn)品適用的樣本類型不止一種，應(yīng)對(duì)所涉及的樣本類型的適用性進(jìn)行評(píng)估；
6.2 為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，企業(yè)應(yīng)根據(jù)不同測(cè)序平臺(tái)的特性確定合適的測(cè)序覆蓋度及深度，并進(jìn)行充分驗(yàn)證；
6.3 生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)庫能直接影響檢測(cè)結(jié)果，因此應(yīng)明確版本信息或最后維護(hù)日期。企業(yè)進(jìn)行軟件或數(shù)據(jù)庫升級(jí)后，應(yīng)評(píng)估對(duì)測(cè)序結(jié)果的潛在影響，以及是否需要對(duì)既往測(cè)序結(jié)果重新分析；
6.4 對(duì)于適用多個(gè)儀器的產(chǎn)品，應(yīng)提供所有適用型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。不同型號(hào)儀器配套的測(cè)序試劑可能不同，且測(cè)序試劑的性能直接影響檢測(cè)試劑的整體質(zhì)量，建議提供測(cè)序試劑的質(zhì)量控制要求。
四、 起草單位
本指導(dǎo)原則由中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所體外診斷試劑二室起草完成。
五、 參考文獻(xiàn)
1. 《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》,（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)），2014年07月30日。
2. 《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社。
3. Guidelines for Diagnostic Next-Generation Sequencing. European Journal of Human Genetics, 2015, 24(1):1584-1589。
4. Next-Generation Sequencing for Infectious Disease Diagnosis and Management: A Report of the Association for Molecular Pathology. The Journal of Molecular Diagnostics, 2015, 17(6):623-634。
5. ACMG Clinical Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing. Genetics in Medicine, 2013, 15(9)。
6. College of American Pathologists' Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing Clinical Tests. Archives of Pathology &Laboratory Medicine, 2014, 139(4)。
7. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline—Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute. NCCLS, MM3-A2, Vol26 No.8, ISBN 1-56238-596-8。
8. Quantitative Molecular Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline. NCCLS, MM6-A, Vol. 23 No.28. ISBN 1-56238-508-9。
9. Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays; Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute. NCCLS, MM17-A, Vol.28 No.9, ISBN 1-56238-661-1。
10. Translating Cancer Genomes and Transcriptomes for Precision Oncology. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66:75-88.
附錄名詞解釋
1. 脫氧核糖核酸（DNA）
核酸的一種。是由特殊序列的脫氧核糖核苷酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核苷酸，起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過核苷酸堿基對(duì)間較弱的氫鍵維系。DNA包含的4中核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人類存在兩種類型的DNA：來自細(xì)胞何種染色體的基因組DNA（gDNA）和線粒體DNA。
2. 核糖核酸（RNA）
核酸的一種。是與DNA類似的單鏈核酸，由核糖核苷酸按照一定的順序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成和其他化學(xué)活動(dòng)中起重要的作用。RNA分子包含信使 RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和其他小RNA等多種類型，分別行使不同的功能。各種RNA的混合物稱為總RNA。
3. 富集（enrichment）
通過特定的方法使得混合細(xì)胞或核酸樣本中待測(cè)核酸的比例增加，例如可以將不想檢測(cè)的核酸成分選擇性去除、或者對(duì)待測(cè)核酸成分進(jìn)行選擇性探針捕獲或PCR擴(kuò)增。
4. 測(cè)序文庫（library）
將生物體的全部基因組核酸或部分核酸切割成一定長度的DNA片段形成的集合，可用于下游的擴(kuò)增和測(cè)序。
5. 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）
對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行體外酶促快速擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)，模擬DNA的自然復(fù)制過程。引物按照堿基配對(duì)與DNA模板互補(bǔ)結(jié)合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照堿基配對(duì)的原則（A對(duì)T，C對(duì)G），從引物開始合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈。
6. 測(cè)序（sequencing）
分析特定核酸片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。
7. 第二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）
又稱大規(guī)模平行測(cè)序、高通量測(cè)序或深度測(cè)序等，指采用"邊合成邊測(cè)序"的原理（光學(xué)法和半導(dǎo)體芯片法）對(duì)于幾十萬到幾百萬核酸分子同時(shí)進(jìn)行的測(cè)序反應(yīng)，再通過生物信息學(xué)分析法得到的待測(cè)樣本的核酸序列等信息的測(cè)序技術(shù)。
8. 靶向性測(cè)序（target sequencing）
對(duì)于特定的核酸區(qū)域，如特定基因、外顯子等區(qū)域，進(jìn)行靶向性測(cè)序檢測(cè)。
9. 外顯子組（exome）
某生物個(gè)體的基因組中蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的全部外顯子的組合。
10. 全外顯子測(cè)序（whole exome sequencing，WES）
指對(duì)基因組中的全部蛋白質(zhì)編碼區(qū)的序列進(jìn)行測(cè)序。
11. 全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）
指對(duì)基因組全序列進(jìn)行測(cè)序。
12. 比對(duì)（alignment）
指根據(jù)兩個(gè)或多個(gè)的核苷酸序列的重合部分，來構(gòu)建連續(xù)的核酸序列，或者據(jù)此找出序列結(jié)構(gòu)變化的錯(cuò)配、插入、缺失及易位部分。
13. 測(cè)序覆蓋度（sequencing coverage）
指測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。
14. 測(cè)序深度（sequencing depth）
指測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值。
15. 接頭（adapter）
指用于偶聯(lián)寡核苷酸片斷的脫氧核苷酸短片段。
16. 條碼（barcode）或標(biāo)簽（index）
指一段特征性的脫氧核苷酸短片段；在多樣本混合檢測(cè)時(shí)，充當(dāng)一個(gè)識(shí)別特定樣本來源的唯一標(biāo)志。
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