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第一節(jié) 概述
血液分析儀（Hematology Analyzer），又稱血細(xì)胞分析儀（Blood Cell Analyzer），也可稱為血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Blood Cell Counter）,主要用于檢測(cè)血液標(biāo)本，能對(duì)血液中有形成分進(jìn)行定性、定量分析，并提供相關(guān)信息的儀器。
一、產(chǎn)品定義、性能及應(yīng)用特點(diǎn)
自50 年代初庫(kù)爾特先生發(fā)明了粒子計(jì)數(shù)技術(shù)的專利,制造了第一臺(tái)血液分析儀并應(yīng)用于臨床以來,血液分析儀的發(fā)展已有60年的歷史。血液分析儀實(shí)質(zhì)上是指對(duì)一定體積內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量及異質(zhì)性進(jìn)行分析的儀器。最初的血球計(jì)數(shù)儀(Cell Counter)僅能計(jì)數(shù)紅細(xì)胞(RED)和白細(xì)胞(WBC),后來又有了血紅蛋白HBG),血小板(PLT),紅細(xì)胞壓積(HCT),平均紅細(xì)胞體積(MCV)等幾個(gè)參數(shù)。而發(fā)展成為血液分析儀 (Hematology Analyzer)后,又增加了許多分析和計(jì)算參數(shù),如紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW),平均血小板體積(MPV),血小板體積分布寬度(PDW),血小板壓積(PCT),大血小板比率,白細(xì)胞三分群,白細(xì)胞五分類,血紅蛋白濃度分布寬度,異常淋巴細(xì)胞提示,幼稚細(xì)胞提示等各種參數(shù)和功能也不斷地添加到一些品牌的儀器上。
為了紀(jì)念庫(kù)爾特先生對(duì)血液分析儀的貢獻(xiàn)，特將其計(jì)數(shù)原理命名為庫(kù)爾特原理（the coulter principle）即電阻抗原理，該原理現(xiàn)已成為血細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析中最經(jīng)典的原理。庫(kù)爾特原理的基本含義是:在待測(cè)液體中置一微孔,在微孔的兩端各加一定電壓的電極,當(dāng)液體中的顆粒經(jīng)過微孔時(shí),電極間的電阻就會(huì)產(chǎn)生瞬間的變化,以因而產(chǎn)生電脈沖,對(duì)這種電脈沖進(jìn)行計(jì)數(shù)就可得到顆粒的數(shù)量,脈沖幅度的大小表示顆粒的體積的大小,經(jīng)過對(duì)各種細(xì)胞所產(chǎn)生脈沖的大小的電子的選者擇,可以區(qū)分出不同種類的細(xì)胞;在液體中加上一定的負(fù)壓就能使經(jīng)過微孔的液體流動(dòng)。
隨著電子技術(shù),流式細(xì)胞技術(shù),激光技術(shù),電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和新熒光化學(xué)物質(zhì)等多種高科技技術(shù)在臨床檢驗(yàn)工作的應(yīng)用,使血液分析儀在自動(dòng)化程度,先進(jìn)功能和完美設(shè)計(jì)方面提高到了一個(gè)嶄新的階段,血液分析儀已經(jīng)不僅僅局限在進(jìn)行常規(guī)的血細(xì)胞分析,還增加了許多擴(kuò)展功能,例如將網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)的計(jì)數(shù)和分析功能加入其中,一些儀器還另外增加了幼稚細(xì)胞分析和有核紅細(xì)胞分析功能,甚至對(duì)血液細(xì)胞中某些寄生蟲進(jìn)行提示,更有一些儀器把流式細(xì)胞分析儀的某些功能合并到血液分析儀上,在進(jìn)行常規(guī)血細(xì)胞分析時(shí)可得到某些淋巴細(xì)胞亞群的分析結(jié)果。
在常規(guī)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上,紅細(xì)胞(RBC),血小板(PLT)共用一個(gè)測(cè)量通道,血紅蛋白含量(HGB)的測(cè)定在任何類型,檔次的儀器中其測(cè)試原理都是相同的。白細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分類有其專用的通道,現(xiàn)就對(duì)分析儀上各測(cè)試項(xiàng)目所使用的技術(shù)方法和原理作些簡(jiǎn)要介紹。
1、血紅蛋白含量測(cè)定
血紅蛋白含量的測(cè)定是在被稀釋的血液中加入溶血?jiǎng)┖?使紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白,后者與溶血?jiǎng)┙Y(jié)合形成血紅蛋白衍生物,進(jìn)入血紅蛋白測(cè)試系統(tǒng),在特定波長(zhǎng)(一般在530-550nm)下比色,吸光度的變化與液體中Hb 含量成比例,儀器便可顯示Hb 濃度。不同系列的血液分析儀配套溶血?jiǎng)┡浞讲煌?形成的血紅蛋白衍生物也不同,但大多數(shù)的最大吸收光譜接近540nm。近年來許多高檔的分析儀上采用了激光散射法進(jìn)行單個(gè)血紅細(xì)胞血紅蛋白的分析,以盡量減少高WBC,乳糜血,高膽紅素等對(duì)HBG 比色的影響。
2、血紅細(xì)胞及血小板的檢測(cè)
血紅細(xì)胞的檢測(cè)是血液分析儀的重要組成部分,紅細(xì)胞的檢測(cè)以往主要還是使用阻抗法對(duì)紅細(xì)胞的數(shù)目和體積計(jì)數(shù),以此分選出不同大小的信號(hào)并打印出紅細(xì)胞體積分布直方圖。但現(xiàn)在也采用光學(xué)和電阻抗法結(jié)合的處理方法對(duì)紅細(xì)胞體積進(jìn)行三維空間分析(3D)以期得到更正確的結(jié)果。如拜爾的ADVIA 120以光散射法檢測(cè)紅細(xì)胞,以低角度前向光散射和高角度散射兩個(gè)測(cè)量系統(tǒng)同時(shí)測(cè)量1 個(gè)紅細(xì)胞,根據(jù)低角度光轉(zhuǎn)換能量的大小測(cè)量單個(gè)紅細(xì)胞體積與總數(shù);根據(jù)高角度的光散射得出單個(gè)血紅蛋白濃度,可準(zhǔn)確得出MCV(平均紅細(xì)胞體積),MCH(平均血紅蛋白含量),MCHC(平均血紅蛋白濃度)測(cè)定值,并繪出紅細(xì)胞散射圖,單個(gè)紅細(xì)胞體積及紅細(xì)胞內(nèi)Hb 含量的直方圖及求出RWD(紅細(xì)胞體積分布寬度),HDW(紅細(xì)胞血紅蛋白分布寬度)等參數(shù)。
由于血小板和紅細(xì)胞體積的明顯差異,很容易用一個(gè)限定閾值將兩者同時(shí)測(cè)得的光電信號(hào)區(qū)分。因此,迄今為止全血分析中血小板,紅細(xì)胞檢查均采用一個(gè)共用的分析系統(tǒng)。但由于血小板和紅細(xì)胞測(cè)量信號(hào)常有交叉,如大血小板的脈沖信號(hào)可能被誤認(rèn)為紅細(xì)胞而計(jì)數(shù),小紅細(xì)胞的脈沖信號(hào)可能進(jìn)入血小板通道,造成實(shí)驗(yàn)誤差。各血液分析儀生產(chǎn)廠家采用多種先進(jìn)技術(shù)以減少血小板計(jì)數(shù)的干擾,以下我們就分別給予介紹:
掃流技術(shù)(sweep flow):由于血小板和紅細(xì)胞在同一個(gè)計(jì)數(shù)池中計(jì)數(shù),紅細(xì)胞體積較大,在通過正中計(jì)數(shù)感應(yīng)區(qū)時(shí)會(huì)形成一個(gè)大脈沖,若有回流會(huì)同時(shí)又產(chǎn)生一個(gè)因渦流再度進(jìn)入感應(yīng)區(qū)邊緣而形成的小脈沖使電極可能感應(yīng)到相當(dāng)于血小板大小的小脈沖,使血小板計(jì)數(shù)假性增多。掃流技術(shù)是在進(jìn)行紅細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)的同時(shí),在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)小孔的后面有一個(gè)穩(wěn)定的液流通過,這樣可以使后的紅細(xì)胞被立即沖走,以防止回到感應(yīng)區(qū)被計(jì)數(shù)為血小板。
傳統(tǒng)血液學(xué)常規(guī)檢查方法是借助于顯微鏡進(jìn)行人工血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血涂片染色后顯微鏡進(jìn)行肉眼人工白細(xì)胞分類，每檢測(cè)一份標(biāo)本至少要20分鐘才能出檢測(cè)報(bào)告，不僅檢測(cè)項(xiàng)目少，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，準(zhǔn)確性、可靠性受到一定影響，難以進(jìn)行質(zhì)量控制。到20 世紀(jì)50 年代血細(xì)胞分析儀(Automated Heamatology Analyzer)問世以來，血細(xì)胞自動(dòng)分析從單一的電阻抗技術(shù)發(fā)展成為多種技術(shù)的融合包括物理學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、信息處理技術(shù)、如體積傳導(dǎo)光散射（VCS）、多角度偏振光散射（MAPSS）等，使對(duì)各種血細(xì)胞分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；自動(dòng)化方面，血細(xì)胞自動(dòng)分析已由單一半自動(dòng)不分類到的三分群/五分類（3/5-part differential）發(fā)展為血細(xì)胞自動(dòng)分析的流水線，即將全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（CBC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（Ret）計(jì)數(shù)、外周血推片和染色等過程實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，臨床應(yīng)用方面，血細(xì)胞自動(dòng)分析的檢測(cè)參數(shù)由單一的血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)展為可向臨床診斷，鑒別診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供數(shù)二十多個(gè)參數(shù)。
近年來，我國(guó)在血液自動(dòng)分析領(lǐng)域也取得了十分可喜的成績(jī)。目前，各級(jí)醫(yī)院、鄉(xiāng)鎮(zhèn)、社區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)血液分析儀已逐步得到普及，CBC 檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度明顯提高；大中型醫(yī)院檢驗(yàn)科擁有多臺(tái)血液分析儀，有的大型或教學(xué)醫(yī)院還擁有血液自動(dòng)分析的流水線；同時(shí)，各級(jí)醫(yī)院已基本建立血液自動(dòng)分析的質(zhì)控程序，大大提高了全血細(xì)胞計(jì)數(shù)（CBC）的工作效率。
第二節(jié) 血液分析儀的發(fā)展歷程
近年來，隨著先進(jìn)儀器的普及應(yīng)用和技術(shù)人員素質(zhì)的提高，我國(guó)的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)事業(yè)有了飛速的發(fā)展。近10 年來，各種類型的血液分析儀在國(guó)內(nèi)迅速普及。血液分析儀的應(yīng)用，不但提高了檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量和工作效率，而且為臨床提供了更多更可靠的試驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)疾病的診斷和鑒別診斷起了重要的作用。同時(shí)也取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
一、血液分析儀的發(fā)展
傳統(tǒng)的血液學(xué)檢查：顯微鏡手工檢驗(yàn)法。血細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性受到一定影響，檢驗(yàn)人員費(fèi)時(shí)費(fèi)力。1947 年美國(guó)科學(xué)家?guī)鞝柼兀╓.H.Coulter）發(fā)明了用電阻法計(jì)數(shù)粒子的專利技術(shù)。1956 年他又將這一技術(shù)應(yīng)用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)獲得成功，其原理是根據(jù)血細(xì)胞非傳導(dǎo)的性質(zhì)，以電解質(zhì)溶液中懸浮血細(xì)胞在通過計(jì)數(shù)小孔時(shí)引起的電阻變化進(jìn)行檢測(cè)為基礎(chǔ)，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積測(cè)定，這種方法稱為電阻法或庫(kù)爾特原理。60 年代末血細(xì)胞分析儀除可進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)外，還可以同時(shí)測(cè)定HBG 血紅蛋白。70 年代計(jì)算機(jī)技術(shù)快速發(fā)展，將血小板計(jì)數(shù)的繁瑣手續(xù)（手工分離富血小板血漿后在進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)），改進(jìn)成血小板與紅細(xì)胞同時(shí)計(jì)數(shù)。80 年代，發(fā)展迅速，在8 項(xiàng)檢測(cè)基礎(chǔ)上加上紅細(xì)胞指數(shù)、三個(gè)直方圖的報(bào)告，不僅提供是否貧血，且可對(duì)貧血的類型和原因進(jìn)行分析；血小板參數(shù)對(duì)止血和血栓疾病的診斷及一些疾病的療效觀察有重要價(jià)值。開發(fā)了白細(xì)胞3 分群血細(xì)胞分析儀。90 年代，開發(fā)出五分類血液分析儀和可對(duì)網(wǎng)狀紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀，同時(shí)，將激光、射頻、化學(xué)染色計(jì)數(shù)應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞檢測(cè)更成熟，發(fā)展成為血液分析流水線。
二．白細(xì)胞分類技術(shù)的進(jìn)展
最早進(jìn)行白細(xì)胞分類的設(shè)備僅根據(jù)白細(xì)胞的體積分布情況將淋巴細(xì)胞單獨(dú)劃分出來。在1970 年起Coulter 公司開始設(shè)計(jì)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類的儀器，并首先推出了二分類的S-PLUS 系列儀器，然后在1980 年又推出了T 系列，都是可進(jìn)行白細(xì)胞二分群的儀器，大家比較熟悉的SysmexF800 和F820 型也是根據(jù)白細(xì)胞體積分布直方圖進(jìn)行粗略兩分類的儀器。目前半自動(dòng)或全自動(dòng)型具有18 參數(shù)含白細(xì)胞三分類的血細(xì)胞分析儀已經(jīng)成為我國(guó)醫(yī)院檢驗(yàn)科的主流血細(xì)胞分析儀。僅僅根據(jù)簡(jiǎn)單的體積分析法就將血細(xì)胞進(jìn)行分類，無論是三分類（3-partdifferential）還是二分類（2- partdifferential），其實(shí)是將細(xì)胞按照體積大小進(jìn)行了簡(jiǎn)單的分群處理，實(shí)際上是不科學(xué)的，因此國(guó)內(nèi)專家建議將此分類統(tǒng)一稱呼為分群（group），即二分群型或三分群型血細(xì)胞分析儀。
第三節(jié) 現(xiàn)代血液分析儀的主要進(jìn)展
隨著高科技的應(yīng)用和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種先進(jìn)的血細(xì)胞分析測(cè)試技術(shù)被應(yīng)用到血液分析儀上。1987 年Coulter 公司發(fā)明的VCS(Volume，V，體積；conductivity，C，電導(dǎo)性；Scatter，S，光散射)技術(shù)可使血細(xì)胞未經(jīng)任何處理，在與體內(nèi)形態(tài)完全相同的自然狀態(tài)下得出檢測(cè)結(jié)果。而在SYSMEX 的NE-8000和SF-3000 血細(xì)胞分析儀中采用了阻抗和射頻技術(shù)聯(lián)合的白細(xì)胞分類法。進(jìn)入90 年代后，儀器的自動(dòng)化程度增高(達(dá)到120 份/小時(shí))；可進(jìn)行多參數(shù)分析(高達(dá)30 余項(xiàng))；精密度高(重復(fù)計(jì)數(shù)；保證微孔管清潔；取中段血；運(yùn)動(dòng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)原理；鞘流原理……)；向5 分類及鑒別幼稚細(xì)胞發(fā)展；準(zhǔn)確度好，全面質(zhì)量管理，保證儀器檢測(cè)可靠性；具有智能化，可對(duì)同一病人診斷的前后進(jìn)行對(duì)比，提出綜合意見，確定診斷方向；更加注意保護(hù)操作人員的安全(SLS-Hb、自動(dòng)混勻、進(jìn)樣、吸樣針內(nèi)外清洗等)；向流水線發(fā)展，將血液分析儀、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、推片、染色機(jī)聯(lián)成流水操作線。
第四節(jié) 血液分析儀白細(xì)胞五分類法原理和散點(diǎn)圖特征
一、簡(jiǎn)要發(fā)展史
1974 年，一種名為HEMALOG D 的具有初步白細(xì)胞分類功能的白細(xì)胞分析儀問世。1982 年，Technicon 公司生產(chǎn)了H6000 型血液細(xì)胞分析儀器，應(yīng)該是首款具有白細(xì)胞五分類能力的儀器。同時(shí)代日本日立公司推出圖像分析法的白細(xì)胞分析儀HITACHI 8200 型，僅僅是用于完成白細(xì)胞血片分類的儀器，沒有其他血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析能力。Technicon 公司1985 年開發(fā)了比較成熟的具有白細(xì)胞五分類功能的Technicon H1 型血液細(xì)胞分析儀，隨后升級(jí)為H2 型和H3 型。COULTER 公司在1987 年開發(fā)研制其經(jīng)典VCS 技術(shù)，并推出持續(xù)具有多年影響力的、具有白細(xì)胞五分類功能的血液細(xì)胞分析儀MAXM 型。
1990 年前后，歐洲和日本許多廠家都陸續(xù)推出了各種類型的具有白細(xì)胞五分類功能的血液分析儀。各廠家設(shè)計(jì)生產(chǎn)的此類血細(xì)胞分析儀，其在白細(xì)胞分類技術(shù)上原理各不相同，分析測(cè)定項(xiàng)目略有不同，且形式多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，試劑種類和成分也趨于復(fù)雜。不斷改進(jìn)和升級(jí)的新產(chǎn)品使得儀器在白細(xì)胞分類技術(shù)上更加成熟和可靠。而技術(shù)的提高也帶來了儀器和消耗品（試劑）價(jià)格的增加。
二、儀器原理和散點(diǎn)圖特點(diǎn)
1、體積、電導(dǎo)和激光散射原理
這是Beckman－Coulter 公司生產(chǎn)的血液分析儀所采用的經(jīng)典分析方法，他集三種物理學(xué)檢測(cè)技術(shù)于一體，在細(xì)胞處于自然原始的狀態(tài)下對(duì)其進(jìn)行多參數(shù)分析。該方法也稱為體積、電導(dǎo)、激光散射血細(xì)胞分析法。此技術(shù)采用在標(biāo)本中首先加入紅細(xì)胞溶血?jiǎng)┤芙獾艏t細(xì)胞，然后加入穩(wěn)定劑來中和紅細(xì)胞溶解劑的作用，使白細(xì)胞表面、胞漿和細(xì)胞體積保持穩(wěn)定不變。然后應(yīng)用鞘流技術(shù)將細(xì)胞推進(jìn)到流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)池（Flowcell）中，接受儀器VCS 三種技術(shù)的檢測(cè)。V 代表體積（Volume）測(cè)量法，是采用經(jīng)典的庫(kù)爾特專利技術(shù)，用低頻電流準(zhǔn)確分析細(xì)胞體積。體積是區(qū)分白細(xì)胞亞群的一個(gè)重要的參數(shù)，它可有效區(qū)分體積大小差異顯著的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。C 代表高頻電導(dǎo)性（Conductivity），采用高頻電磁探針原理測(cè)量細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)間的差異，也是該公司的專利技術(shù)。
細(xì)胞膜對(duì)高頻電流具有傳導(dǎo)性，當(dāng)電流通過細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核的化學(xué)組份可使電流的傳導(dǎo)性產(chǎn)生變化，其變化量可以反映出細(xì)胞內(nèi)含物的信息。該參數(shù)可用來區(qū)分體積相近而內(nèi)部性質(zhì)不同的細(xì)胞群體，如淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，由于它們的細(xì)胞核特性不同而在傳導(dǎo)性參數(shù)上有所區(qū)別。S 代表激光散射（Scatter）測(cè)量技術(shù)，采用氦氖激光源發(fā)出的單色激光掃描每個(gè)細(xì)胞，收集細(xì)胞在10°～70°角度內(nèi)出現(xiàn)的散射光(MALS)信號(hào)。該激光束可穿透細(xì)胞，探測(cè)細(xì)胞內(nèi)核分葉狀況和胞漿中的顆粒情況，提供有關(guān)細(xì)胞顆粒性的信息，可以區(qū)分出顆粒特性不同的細(xì)胞群體。例如細(xì)胞內(nèi)顆粒粗的要比顆粒細(xì)的散射光更強(qiáng)，因此可以用于區(qū)分粒細(xì)胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜堿性三種細(xì)胞。
儀器將分析每個(gè)細(xì)胞在V、C、S 三種檢測(cè)技術(shù)上的測(cè)量結(jié)果，因?yàn)椴煌悇e的細(xì)胞會(huì)在體積、表面特征、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面呈現(xiàn)明顯的不同。將這些特征性信息被定義到以VCS 為三維坐標(biāo)(分辨率為256×256×256=16,777,216)所形成的立體散點(diǎn)圖中，這五類細(xì)胞可在三維空間中形成特定的細(xì)胞群。通過計(jì)算某群細(xì)胞數(shù)量占白細(xì)胞總數(shù)的百分比，即可得到五項(xiàng)白細(xì)胞分類結(jié)果。儀器不僅僅做出對(duì)正常白細(xì)胞的五項(xiàng)分類結(jié)果，給出典型的散點(diǎn)圖型，還可以提示許多異常細(xì)胞區(qū)域的報(bào)警。
VCS 技術(shù)可通過DF1、DF2、DF3 三個(gè)散點(diǎn)圖將五種類型白細(xì)胞明顯區(qū)分開。三個(gè)散點(diǎn)圖的縱坐標(biāo)均定義為細(xì)胞體積。DF1 為細(xì)胞體積和激光散射的直方圖，DF2 和DF3 為細(xì)胞體積和高頻電導(dǎo)性的直方圖，DF3 為除去粒細(xì)胞群體后顯示出淋巴細(xì)胞后面的嗜堿性粒細(xì)胞圖像。VCS 技術(shù)是Beckman－Coulter 公司開發(fā)研制的經(jīng)典專有方法，到目前為止的各種高檔血細(xì)胞分析儀均采用該方法對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析。該方法在白細(xì)胞分析上尚有特殊能力，例如可以測(cè)定和分析中性粒細(xì)胞的體積、核漿比例、細(xì)胞顆粒特性等參數(shù)，也就是將中性粒細(xì)胞的VCS 三個(gè)參數(shù)分別給出，用于了解細(xì)菌感性疾病與其它疾病的區(qū)別。也可對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等均作出其細(xì)胞群體的三個(gè)技術(shù)參數(shù)值，是比較有前景的研究?jī)?nèi)容。
儀器在RBC、PLT、WBC 計(jì)數(shù)上依然采用電阻抗法，血紅蛋白仍然采用比色法測(cè)定。該公司的五分類法血細(xì)胞分析儀先后推出多種類型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755 和最新的LH780 等型號(hào)，在某些機(jī)型還具有網(wǎng)織紅細(xì)胞分析功能和T 淋巴細(xì)胞亞群分析功能。
2、電阻抗、射頻和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
日本Sysmex 公司系列血液分析儀是在國(guó)內(nèi)應(yīng)用非常廣泛的儀器，從三分類法到五分類法的各種型號(hào)儀器都有大量用戶。其儀器型號(hào)種類豐富，功能和測(cè)定參數(shù)各異，其各種儀器間均有近似的檢測(cè)原理，但在結(jié)合特定的功能以達(dá)到不同的分析目的方面，其原理和所用試劑又有不完全相同之處。以XE-2100型血細(xì)胞分析儀為例說明其在白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類方面的原理和特點(diǎn)。
Sysmex XE-2100 在白細(xì)胞分類上采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。半導(dǎo)體激光照射在通過鞘流技術(shù)處理的細(xì)
胞上，可根據(jù)每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的三種信號(hào)來鑒別細(xì)胞類別。前向散射光（FSC）信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞體積大��；側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)可反應(yīng)細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞核
等內(nèi)含物的信息；側(cè)向熒光（SFL）強(qiáng)度信號(hào)則用于分析細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量。
在白細(xì)胞分析上主要采用兩個(gè)通道進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，兩個(gè)通道均采用激光和鞘流進(jìn)樣的方式測(cè)定。DIFF 通道： STROMATOLYSER-4DL 試劑中的表面活性劑可以溶解掉標(biāo)本中的紅細(xì)胞和血小板，并在白細(xì)胞膜上打出小孔；然后第二種試劑STROMATOLYSER-4DS 中的聚次甲基染料通過這個(gè)小孔進(jìn)入白細(xì)胞中，與細(xì)胞核的核酸和細(xì)胞器結(jié)合，在經(jīng)過波長(zhǎng)633nm 的激光照射，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL 試劑還具有與嗜酸性顆粒特異性結(jié)合的能力，可根據(jù)側(cè)向散射光信號(hào)強(qiáng)度，將嗜酸性粒細(xì)胞從中性粒細(xì)胞中分離出來。這樣可以將中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞清楚的分離開。在DIFF 散射圖當(dāng)中可以得到白細(xì)胞的四個(gè)分群（LMNE）。
WBC/BASO 通道是專用作檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞的通道，因?yàn)槭葔A性粒細(xì)胞數(shù)量非常少，因此必須采用特殊技術(shù)處理。STROMATOLYSER –FB 是一種酸性試劑，可將紅細(xì)胞和血小板形成淡影化，將除嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞處理成裸核形態(tài)，然后采用前向散射光（FSC）信號(hào)和側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)使嗜堿性粒細(xì)胞從其它細(xì)胞中分離出來。前向散射光與細(xì)胞體積測(cè)定相關(guān)，側(cè)向散射光與裸核后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有關(guān)。在這個(gè)通道中可以獲得白細(xì)胞總數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量。
儀器在幼稚粒細(xì)胞分析上有特殊的IMI 通道，在IMI 檢測(cè)通道中主要應(yīng)用射頻（RF）技術(shù)和直流電阻抗法（DC）。這個(gè)測(cè)定通道根據(jù)幼稚細(xì)胞膜表面比成熟細(xì)胞膜表面含有脂質(zhì)少的現(xiàn)象，在稀釋液中加入硫化氨基酸（IM 試劑），由于占位不同，結(jié)合在幼稚細(xì)胞表面的氨基酸較多，對(duì)溶血?jiǎng)┯械挚棺饔茫瑢?duì)幼稚細(xì)胞具有保護(hù)作用。當(dāng)加入溶血?jiǎng)┖蟪墒旒?xì)胞易被溶解掉，而幼稚細(xì)胞不易被溶解破壞，可通過電阻法檢測(cè)出來。射頻技術(shù)用于測(cè)量細(xì)胞核的大小和顆粒的多少，而直流電信號(hào)可反應(yīng)出細(xì)胞體積的大小。
在有核紅細(xì)胞計(jì)數(shù)上通過專門的有核紅細(xì)胞檢測(cè)程序和專用通道-NRBC 通道，在處理標(biāo)本時(shí)加入STROMATOLYSER－NR 專用試劑，它能使成熟紅細(xì)胞溶解
又可保持有核紅細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)，同時(shí)也將白細(xì)胞保持完好。STROMATOLYSER－NR試劑中的聚次甲基熒光染料可滲透進(jìn)入白細(xì)胞膜內(nèi)，將白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的核染色。通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度得到：白細(xì)胞核大熒光強(qiáng)度高，有核紅細(xì)胞核小，熒光強(qiáng)度低，正常紅細(xì)胞無細(xì)胞核和破碎，熒光強(qiáng)度極低。根據(jù)熒光強(qiáng)度差和前向散射光信號(hào)測(cè)定的細(xì)胞體積差，可將有核紅細(xì)胞從其他細(xì)胞群中區(qū)分出來。該儀器在紅細(xì)胞和血小板的計(jì)數(shù)和分析上仍然沿用了經(jīng)典的電阻抗方法，在血紅蛋白測(cè)定上采用了無劇毒物質(zhì)的SLS 溶血?jiǎng)┍壬ā?/p>
3、激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)
最早采用該技術(shù)的是Technicon 公司的H1,H3 型，現(xiàn)在的最新型為西門子公司的Advia120 型和2120 型（2007 年以前為Bayer 公司產(chǎn)品）。它是一款開發(fā)比較早的高等級(jí)儀器，其在白細(xì)胞分類上采用了過氧化酶測(cè)定通道和嗜堿粒細(xì)胞測(cè)定通道。根據(jù)細(xì)胞化學(xué)染色的特性進(jìn)行白細(xì)胞分類。在紅細(xì)胞和血小板分析都采用了雙角度激光法。在儀器的管路、電磁閥門、反應(yīng)杯上采用了獨(dú)特設(shè)計(jì)的集成液流版管路系統(tǒng)，是目前血細(xì)胞分析儀中所獨(dú)有和特有的技術(shù)。集成液流板實(shí)際上是將各種管路和電磁閥門、反應(yīng)杯等血球計(jì)數(shù)儀的常用硬件進(jìn)行綜合處理，系統(tǒng)化，微小化，透明化和集成化。形成的集成板被放置在儀器的明顯部位，方便觀察，并具一定的美觀效果。其另一特點(diǎn)則是細(xì)小的管路和反應(yīng)杯可是標(biāo)本和試劑用量明顯減少。
在白細(xì)胞分類上，該儀器采用兩個(gè)通道進(jìn)行，一個(gè)為過氧化酶檢測(cè)通道，另一個(gè)為嗜堿細(xì)胞檢測(cè)通道。過氧化酶反應(yīng)（peroxidase，POX）是血涂片染色的一個(gè)常用細(xì)胞化學(xué)染色方法，用于鑒別原始細(xì)胞與成熟的粒細(xì)胞，鑒別粒細(xì)胞與非粒細(xì)胞。染色后的細(xì)胞內(nèi)無藍(lán)黑色顆粒出現(xiàn)為陰性反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)小顆粒或稀疏樣分布的黑色顆粒為弱陽(yáng)性反應(yīng)，出現(xiàn)黑色粗大而密集的顆粒為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。過氧化物酶主要存在于粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系中，各類白細(xì)胞對(duì)過氧化物酶的反應(yīng)是這樣的：早期的原始粒細(xì)胞為陰性，早幼粒以后的各階段都含有過氧化物酶，并隨著細(xì)胞的成熟過氧化酶含量逐漸增強(qiáng)，中性分葉核粒細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，嗜酸性粒細(xì)胞具有最強(qiáng)的過氧化物酶反應(yīng)，嗜堿粒細(xì)胞不含此酶呈陰性反應(yīng)。在單核細(xì)胞系統(tǒng)，除早期原始階段外，幼稚單核和單核細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較弱的過氧化物酶反應(yīng)。淋巴細(xì)胞、幼稚紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞等都為過氧化物酶陰性反應(yīng)。Advia 120/2120 血細(xì)胞分析儀的過氧化酶（Perox）檢測(cè)通道就是根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)的，它檢測(cè)每一個(gè)通過流動(dòng)計(jì)數(shù)池中的白細(xì)胞，經(jīng)過激光照射所產(chǎn)生的過氧化酶散射光吸收率，來當(dāng)然試劑和輔助試劑均進(jìn)行了改良。
在Perox 通道所產(chǎn)生的散點(diǎn)圖，橫軸表示在5°-15°激光散射獲得的細(xì)胞過氧化物酶含量情況，縱軸是低角度散射光測(cè)量的細(xì)胞體積大小。在此通道內(nèi)細(xì)胞被分為五類。1）過氧化酶最強(qiáng)陽(yáng)性的嗜酸性粒細(xì)胞；2）過氧化酶強(qiáng)陽(yáng)性的嗜中性分葉核粒細(xì)胞；3）體積較大、過氧化酶弱陽(yáng)性的單核細(xì)胞；4）體積較小、過氧化物酶陰性的淋巴細(xì)胞；5)體積大于淋巴細(xì)胞且過氧化物酶陰性的未染色大細(xì)胞，此類細(xì)胞增加提示幼稚或原始的各類細(xì)胞可能出現(xiàn)。在嗜堿細(xì)胞（BASO）通道中采用的檢測(cè)原理是：專用的嗜堿性粒細(xì)胞試劑（BASO）將除了嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞除去細(xì)胞膜，使其裸核化并體積變小，僅將嗜堿性粒細(xì)胞保持原有狀態(tài)，體積明顯大于其他類的白細(xì)胞。在散點(diǎn)圖上處于上面區(qū)域的為嗜堿性粒細(xì)胞；散點(diǎn)圖的橫坐標(biāo)可表示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，處于左側(cè)的為單個(gè)核的細(xì)胞群，包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；處于右側(cè)的為分葉核細(xì)胞；中間部位則考慮為桿狀核細(xì)胞；左下端為單個(gè)核的原始細(xì)胞區(qū)。
該儀器在紅細(xì)胞、血小板的測(cè)定上也采用了光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。通過激光照射掃描每個(gè)通過Flowcell 的紅細(xì)胞，低角度散射光（2 °~3 °）用于測(cè)量細(xì)胞體積；高角度(5°～15°)散射光測(cè)量每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白濃度（CH）和血紅蛋白含量平均值CHCM。這兩個(gè)值不受紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白測(cè)定的影響。還可根據(jù)每個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白濃度，計(jì)算出紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白分布寬度（HDW）值。其根據(jù)紅細(xì)胞在體積大小和單個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量的分析，將紅細(xì)胞劃分為9 個(gè)區(qū)域，得到紅細(xì)胞體積和色素含量分布的九分圖，也是該儀器在紅細(xì)胞分析方面獨(dú)有的特色，根據(jù)紅細(xì)胞分布情況可初步判斷疾病類別。在血小板計(jì)數(shù)分析上也同樣采用了二維光散射分析法，即可獲得血小板體積大小，可測(cè)量1~60fl 內(nèi)的各種大小不同的血小板，還可對(duì)血小板內(nèi)容物含量（MPC）進(jìn)行測(cè)定。血紅蛋白測(cè)定采用連續(xù)流動(dòng)比色法和紅細(xì)胞散射光直接測(cè)定法兩種方法，有助于高脂血和高膽紅素血標(biāo)本的血紅蛋白測(cè)定準(zhǔn)確性。
4、雙鞘流技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色法
ABX 是法國(guó)生產(chǎn)血液分析儀的著名廠家，其生產(chǎn)的全自動(dòng)血液分析儀Pentra 120 型為其高端產(chǎn)品。在白細(xì)胞分類上采用該公司特有的專利技術(shù)-雙鞘流（DHSS）分析法。雙鞘流是專利技術(shù)，而測(cè)定本身是通過電阻抗和光吸收法雙重原理。標(biāo)本首先在第一鞘流液中經(jīng)過電阻抗測(cè)定分析，得到細(xì)胞體積測(cè)定結(jié)果，然后通過第二鞘流引導(dǎo)再行光吸收率分析，對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)定，最終將細(xì)胞測(cè)定信息在散射圖相應(yīng)的位置表現(xiàn)出來。雙鞘流技術(shù)的核心部件是含有紅寶石小孔的復(fù)雜的鞘流池，在雙鞘流系統(tǒng)的上下兩端分別加上恒定電流，是保證電阻法的測(cè)量要素。為了保證被檢測(cè)的細(xì)胞能夠正確通過計(jì)數(shù)孔和鞘流通道，需要利用外來鞘流來進(jìn)行矯正，因此通過左側(cè)鞘流泵注入稀釋液形成第一鞘流液，其作用是保護(hù)溶液能夠直接通過計(jì)數(shù)小孔，并且保證其中攜帶的細(xì)胞處于中心部位，液流不發(fā)生偏移和扭曲；溶液通過計(jì)數(shù)小孔后，再通過中間鞘流泵注入稀釋液形成第二股鞘流，用以保證吸光度測(cè)量。這樣的過程被稱為雙鞘流分析技術(shù)。
儀器通過兩個(gè)通道來完成白細(xì)胞的五項(xiàng)分類。其采用的細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)（Cytochemistry）的原理是經(jīng)典的細(xì)胞分類技術(shù)，此染色劑中含有溶血素及氯唑黑活體染料（Chlorazol Black E）。在儀器的LMNE 檢測(cè)池中，全血樣品與染色劑充分混勻，在35℃條件下進(jìn)行孵育，此過程的作用是：①溶解紅細(xì)胞②對(duì)單核細(xì)胞的初級(jí)顆粒、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的特異顆粒進(jìn)行不同程度的染色，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的膜（細(xì)胞膜、核膜、顆粒膜）也進(jìn)行不同程度的著色③固定細(xì)胞的形態(tài)，使其保持自然狀態(tài)。由于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)染色劑的著色程度不同、每種細(xì)胞特定的細(xì)胞核形態(tài)和顆粒的結(jié)構(gòu)造成光散射的強(qiáng)度不同，產(chǎn)生了特定的吸光率。
染色后的標(biāo)本被引導(dǎo)進(jìn)入鞘流池進(jìn)行雙鞘流分析，首先經(jīng)過60mm 紅寶石小孔進(jìn)行電阻法分析，用于判斷細(xì)胞體積大小，在LMNE 散點(diǎn)圖上的橫坐標(biāo)即可表示出細(xì)胞大小的特性。然后樣本迅速進(jìn)入直徑為42mm 的第二鞘流檢測(cè)通道進(jìn)行光吸收率測(cè)定，以判斷細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)容物等情況。根據(jù)每類細(xì)胞在這兩個(gè)分析參數(shù)上所表現(xiàn)出來的特性，形成二維分布的散點(diǎn)圖。在此通道內(nèi)可完成白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞群的分類。此通道內(nèi)在分析的同時(shí)還能夠檢測(cè)兩群異常白細(xì)胞亞群：巨大未成熟細(xì)胞（LIC）百分比及絕對(duì)值，異型淋巴細(xì)胞（ALY）百分比及絕對(duì)值，同時(shí)還可提供多達(dá)82 種提示和報(bào)警信息。
在LMNE 散點(diǎn)圖上，各類白細(xì)胞的特點(diǎn)是：①淋巴細(xì)胞：典型的淋巴細(xì)胞體積較小、形態(tài)規(guī)則、胞漿內(nèi)沒有顆粒，其吸光率最低，所以定位在散點(diǎn)圖的右下部矩陣中，正常淋巴細(xì)胞散點(diǎn)圖為正態(tài)體積分布。②單核細(xì)胞：典型的單核細(xì)胞體積較大、腎狀核、胞漿內(nèi)有初級(jí)顆粒（幾乎不著色），細(xì)胞核大且不分葉，光散射較少，所以位于吸光率軸的最下端，依據(jù)單核細(xì)胞的體積，位于體積軸的最右端，而異常單核細(xì)胞及特大單核細(xì)胞則可能出現(xiàn)在LIC 的矩陣中。③中性粒細(xì)胞：典型的中性粒細(xì)胞具有嗜中性顆粒及分葉核的結(jié)構(gòu)，中性顆粒部分著色，同時(shí)由于顆粒及核的分葉等形態(tài)上的復(fù)雜性，而產(chǎn)生光散射。所以中性粒細(xì)胞群散點(diǎn)圖位于中部。核分葉越多的中性粒細(xì)胞，吸光性越強(qiáng)，在散點(diǎn)圖上的位置向右移。同時(shí)桿狀細(xì)胞（Bands）體積與中性粒細(xì)胞接近，但核的復(fù)雜程度低，吸光率低，散點(diǎn)圖位于中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞之間。④嗜酸性粒細(xì)胞：由于嗜酸性粒細(xì)胞含有特異性顆粒，與染色液特異性著色，其著色強(qiáng)度最深，位于Y-軸的最上端，此方法提高了嗜酸性粒細(xì)胞的分類的準(zhǔn)確性。⑤巨大未成熟細(xì)胞（Large Immature Cell）：未成熟粒細(xì)胞因其體積較大，可含有顆粒，光散射強(qiáng)，位于嗜中性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖的右側(cè)，在LIC 矩陣圖中從左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒細(xì)胞，另外各種原始細(xì)胞位于單核細(xì)胞的右側(cè)區(qū)域中。由于此散點(diǎn)圖中可能有大單核細(xì)胞，可引起LIC 假性計(jì)數(shù)增加（LIC 的計(jì)數(shù)結(jié)果被計(jì)算到在嗜中性粒細(xì)胞中）。LIC 包括：大單核細(xì)胞、高嗜堿性的單核細(xì)胞、巨大中性粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞、原始細(xì)胞。⑥異型淋巴細(xì)胞(Atypical Lymphs)：在散點(diǎn)圖中位于淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的一群細(xì)胞，包括：小原始粒細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞等。
在WBC/BASO 檢測(cè)池中，全血樣品與BasolyseII（PH2.4）溶血?jiǎng)┗旌�，�?5°C 恒溫下，溶解紅細(xì)胞，由于嗜堿性粒細(xì)胞具有抗酸性，能夠保持形態(tài)完整，而其他白細(xì)胞胞漿溢出，成為裸核狀態(tài)。細(xì)胞通過一個(gè)直徑為80mm 的鞘流微孔時(shí)，根據(jù)電阻抗原理進(jìn)行測(cè)定，以細(xì)胞體積大小為橫坐標(biāo)繪制WBC/BASO 直方圖。依據(jù)閾值設(shè)定區(qū)分裸核化的白細(xì)胞與嗜堿性粒細(xì)胞。在直方圖上可以看出在中心界標(biāo)左側(cè)的是細(xì)胞體積變小的其它細(xì)胞群，界標(biāo)右側(cè)是體積較大的嗜堿性粒細(xì)胞。因嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量極少，因此在直方圖上基本見不到明顯分布曲線和峰。
紅細(xì)胞和血小板仍然采用電阻抗原理測(cè)定，血紅蛋白采用比色法。此為在軟件系統(tǒng)中采用了浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)用于血小板計(jì)數(shù)及嗜堿細(xì)胞計(jì)數(shù)，直方圖的界標(biāo)會(huì)依據(jù)細(xì)胞群的變化做出相應(yīng)的自動(dòng)調(diào)整。血小板計(jì)數(shù)上還采用了防返流裝置，目的為防止渦流現(xiàn)象對(duì)血小板計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。在白細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中還采用了白細(xì)胞平衡檢測(cè)原理（WBC Count Balance），使得白細(xì)胞計(jì)數(shù)在WBC/HGB 通道中與LMNE 雙鞘流池計(jì)數(shù)結(jié)果相聯(lián)系，如果出現(xiàn)較大差別則可進(jìn)行報(bào)警提示。最近該廠推出新一代ABX Pentra DX120 型血細(xì)胞分析儀，其測(cè)定原理仍然采用雙鞘流技術(shù)。采用新技術(shù)擴(kuò)展了散點(diǎn)圖分布范圍，形成可對(duì)血液中未成熟的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞共20 個(gè)參數(shù)的分類或提示性報(bào)告信息，這對(duì)異常血細(xì)胞的篩檢提供了很大幫助。
5、多角度偏振光激光散射技術(shù)
美國(guó)雅培公司（ABBOTT）推出的血液分析儀，在白細(xì)胞分類中采用獨(dú)特的多角度偏振光散射（MAPSS）技術(shù)，其所生產(chǎn)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀從CELL-DYN 3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（藍(lán)寶石），在白細(xì)胞分類上均采用了MAPSS 技術(shù)。該技術(shù)基本原理是細(xì)胞在激光束的照射下，在多個(gè)角度都產(chǎn)生散射光，儀器在四個(gè)角度的四個(gè)檢測(cè)器將接收到的相應(yīng)的散射光信號(hào)，然后經(jīng)過微處理器分析處理，將各類細(xì)胞安置在散點(diǎn)圖上的相應(yīng)位置，并計(jì)算出白細(xì)胞分類結(jié)果。
多角度偏振光散射白細(xì)胞分類技術(shù)（ Multi—Angle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。其白細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，因嗜堿性粒細(xì)胞顆粒具有吸濕的特性，所以嗜堿性粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有輕微改變。紅細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓高于鞘液滲透壓而發(fā)生改變，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白從細(xì)胞內(nèi)游離出來，而鞘液內(nèi)的水分進(jìn)入紅細(xì)胞中，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整，但此時(shí)的紅細(xì)胞折光指數(shù)與鞘液的相同，故紅細(xì)胞不干擾白細(xì)胞檢測(cè)。在鞘流系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個(gè)直徑30μm 的小股液流，該液流將稀釋的血細(xì)胞單個(gè)排列，然后通過激光束，激光照射于細(xì)胞上，在各個(gè)方向都有其散射光出現(xiàn)。0°為前向角散射（1°～3°）光，可粗略地測(cè)定細(xì)胞大��；②10°為狹角散射光（7°～11°），可測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性的相對(duì)特征；③90°為消偏振光散射（70°`～110°），基于顆�？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦�，將嗜酸細(xì)胞從中性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞中分離出來。④90°垂直光散射（70°～110°），主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)部顆粒和細(xì)胞成分進(jìn)行測(cè)量。這四個(gè)角度同時(shí)對(duì)單個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和分析后，即可將白細(xì)胞劃分為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞5 種。ABBOTT 的五分類法定量很有意思，不用傳統(tǒng)的體積定量，而是采用數(shù)量定量，每次計(jì)數(shù)時(shí)完成10000 個(gè)細(xì)胞測(cè)定即停止。
該類型儀器除了基本的白細(xì)胞五分類外，還提供了其它異常白細(xì)胞的信息和報(bào)警，提供給檢驗(yàn)者參考，以通過人工顯微鏡檢查復(fù)核這些結(jié)果，例如異常
淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞、未成熟粒細(xì)胞、桿狀核中性粒細(xì)胞。國(guó)內(nèi)桂林優(yōu)利特公司生產(chǎn)的URIT系列五分類血細(xì)胞分析儀，采用相同的分類技術(shù)，經(jīng)過多年的發(fā)展，在市場(chǎng)上得到了用戶的好評(píng)，并榮獲2013年國(guó)家高性能醫(yī)學(xué)診療設(shè)備重大專項(xiàng)獎(jiǎng)。
6、激光散射技術(shù)
日本光電公司是開發(fā)和生產(chǎn)五分類血細(xì)胞分析儀的廠家之一，目前所知僅有兩款類型的儀器投入市場(chǎng)，均采用相同的測(cè)定原理，型號(hào)是MEK-7222K和MEK-8222K。其WBC、RBC 和PLT 計(jì)數(shù)原理采用電阻法，白細(xì)胞分類測(cè)定采用鞘流技術(shù)和激光散射原理。在鞘流液中白細(xì)胞通過管路進(jìn)入鞘流池內(nèi)，激光照射白細(xì)胞后發(fā)生的各種散射光，根據(jù)血細(xì)胞的體積、血細(xì)胞的復(fù)雜性（有無顆粒、核的構(gòu)造等）的不同，散射光的強(qiáng)度和方向有所不同。激光直進(jìn)方向和同方向小角度的散射光（表示Size）、激光直進(jìn)方向和同方向大角度的散射光（表示Complexity）、與激光直進(jìn)方向相對(duì)垂直的方向的散射光（表示Granularity）為參數(shù)的作為散點(diǎn)圖，對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行分類。Size 表示血細(xì)胞的大小、Complexity 表示白細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度、Granularity 表示白細(xì)胞顆粒的程度。采用此原理可提供了三個(gè)散射圖，MAIN 散點(diǎn)圖、NE-EO 散點(diǎn)圖和MO-BA 散點(diǎn)圖。在MAIN 散點(diǎn)圖上（大圖部分）下面散點(diǎn)表示淋巴細(xì)胞群，右側(cè)為粒細(xì)胞群；兩個(gè)小圖，NE-EO 為中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖，MO-BA 為單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞散點(diǎn)圖。此外儀器還能給出大的不成熟細(xì)胞（LIC）提示信息。
7、邁瑞激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)
邁瑞（MINDRAY）公司是國(guó)內(nèi)最早有能力生產(chǎn)五分類血細(xì)胞分析儀的廠家，他們目前生產(chǎn)的五分類血細(xì)胞分析儀、BC-5800 檢測(cè)速度快：全自動(dòng)進(jìn)樣90個(gè)樣本/小時(shí)，開放進(jìn)樣80個(gè)樣本/小時(shí)型自動(dòng)五分類血液細(xì)胞分析儀，采用半導(dǎo)體激光散射技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，配合改良的流式分析裝置對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行精確的五分類分析。BC-6900 檢測(cè)速度：最高125 個(gè)標(biāo)本/ 小時(shí)為目前最高配置，可選擇使用靜脈血或預(yù)稀釋末梢血，均能獲得良好的各種細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和白細(xì)胞五分類結(jié)果。具有血液和體液檢測(cè)功能，有六個(gè)通道、九種模式。
鞘流技術(shù)是所有高檔血細(xì)胞分析儀均采用的細(xì)胞進(jìn)樣技術(shù)，為了達(dá)到更高的液流速度壓力差和更穩(wěn)定的液體流動(dòng)，該公司獨(dú)創(chuàng)性地采用了二次加速鞘流技術(shù)，分級(jí)實(shí)現(xiàn)鞘液的第二次加速，增加了單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的通過流量，從而能夠完成對(duì)預(yù)稀釋血液進(jìn)行白細(xì)胞五分類分析。
儀器通過兩個(gè)通道完成白細(xì)胞分類測(cè)定。在DIFF 通道中增加了利用了可對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行染色的特殊試劑。激光散射分析技術(shù)是五分類法常用的分析技術(shù)，由于細(xì)胞的物理特性，當(dāng)激光照射到細(xì)胞時(shí)，會(huì)有不同角度的散射光出現(xiàn)。低角度(1°~5°)散射光可反映細(xì)胞體積大小信息；中高角度(10°~20°)散射光可反映細(xì)胞顆粒的復(fù)雜性信息。綜合這兩個(gè)角度散射光的信息，結(jié)合其他特殊技術(shù)來完成白細(xì)胞的五分類測(cè)定。標(biāo)本在鞘流的帶動(dòng)下進(jìn)入儀器的檢測(cè)區(qū)域后，激光照射于細(xì)胞之上所發(fā)射出的低角度和中高角度散射光信號(hào)可表現(xiàn)出細(xì)胞大小和內(nèi)容物復(fù)雜程度（包括細(xì)胞內(nèi)顆粒等）的特性信息，經(jīng)儀器檢測(cè)分析，將其分布在一個(gè)二維空間的散點(diǎn)圖中，可區(qū)分淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。而化學(xué)染色技術(shù)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的準(zhǔn)確判定。
在WBC/BASO 通道中通過強(qiáng)溶型試劑和特異性染色技術(shù)，可保留完整的嗜堿性粒細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行特異性修飾，同時(shí)破壞其它四類白細(xì)胞，使之形成膜包核狀態(tài)，在激光的照射下同樣形成兩個(gè)角度的散射光，完整的嗜堿性粒細(xì)胞體積偏大，其他類別白細(xì)胞體積變小，通過激光信號(hào)的強(qiáng)弱來計(jì)數(shù)嗜堿性粒細(xì)胞并在該通道中計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。該方法可以有效排除難溶性紅細(xì)胞、巨大血小板、血小板聚集及其它非細(xì)胞顆粒等因素對(duì)計(jì)數(shù)的影響，保證嗜堿性粒細(xì)胞及WBC 總數(shù)的精確分類和計(jì)數(shù)。
第五節(jié)核酸熒光染色技術(shù)在血液分析儀的最新應(yīng)用
一、概述
目前，五分類血液分析儀已經(jīng)為許多大中型醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室所使用。五分類儀器不同于三分類儀器的主要區(qū)別在于：為了精確定量地檢測(cè)白細(xì)胞的五種成份，各種五分類血液分析儀開始采用多種物理學(xué)原理（電阻抗、光散射、高頻波技術(shù)），甚至設(shè)置專用檢測(cè)通道和化學(xué)染色方法檢測(cè)數(shù)目最少的嗜酸、嗜堿性粒細(xì)胞。
而高檔次的五分類血液分析儀，除了檢測(cè)正常白細(xì)胞五項(xiàng)分類以外，還致力于高靈敏地檢測(cè)幼稚、異常成份。對(duì)于外周血中的幼稚成份，過去一般依賴于顯微鏡鏡檢。而普通血液分析儀對(duì)異常標(biāo)本報(bào)警的靈敏度有限，常常造成漏報(bào)�；蛘邽榱藴p少這種情況而提高陽(yáng)性報(bào)警率（通過降低儀器報(bào)警的閾值），提高了復(fù)片的比例從而造成假陽(yáng)性率偏高，失去了過篩的意義。鑒于以上這些問題， SYSMEX 近年來開始致力于通過化學(xué)染色方法對(duì)幼稚成份的標(biāo)本進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，這相對(duì)于一般的陽(yáng)性報(bào)警（即提供一種可能性）要進(jìn)步了很多。
對(duì)于紅細(xì)胞系統(tǒng)，幼稚成份主要是網(wǎng)織紅細(xì)胞和有核紅細(xì)胞檢測(cè)，提供定量的參數(shù)甚而可以對(duì)RET 成熟度作進(jìn)一步的分類。在白細(xì)胞中，幼稚成份根據(jù)形態(tài)學(xué)的不同包括原始細(xì)胞、核左移細(xì)胞、幼稚粒細(xì)胞、異常/ 異型淋巴等。能否采用特殊的方法學(xué)（如核酸染色方法）高靈敏度地測(cè)得幼稚白細(xì)胞的存在，甚至提供定量的參數(shù)，是儀器優(yōu)劣的標(biāo)志之一。除了幼稚細(xì)胞以外，其它一些異常標(biāo)本的檢出率和準(zhǔn)確性也通過技術(shù)的進(jìn)步而得到提高。對(duì)于巨大血小板、血小板凝集、小紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片等標(biāo)本，使用傳統(tǒng)的電阻抗原理往往無法準(zhǔn)確測(cè)的，而新的核酸染色技術(shù)結(jié)合光學(xué)流式原理則可以較好地解決。因此，可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出幼稚的紅、白細(xì)胞存在（而非提供可能性），并具有血小板的形態(tài)辨識(shí)功能，成為血液分析儀發(fā)展的最前沿的功能。
二、核酸熒光染色技術(shù)
1.在白細(xì)胞系分析的應(yīng)用
a. 正常五項(xiàng)分類的分析應(yīng)用
由于電阻抗原理的局限性，二分群、三分群儀器都無法準(zhǔn)確地檢測(cè)出淋巴、單核、嗜酸性、嗜堿性、嗜中性細(xì)胞。為了能夠從細(xì)胞體積大小到內(nèi)部結(jié)構(gòu)全面分析細(xì)胞并得到準(zhǔn)確的白細(xì)胞分類結(jié)果，各種型號(hào)的五分類儀器采用了各項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于血液細(xì)胞的分析，包括物理原理（電阻抗、散射光、高頻波/ 射頻等）、化學(xué)原理（特異性溶血、普通顆粒染色、酶染色、核酸染色）。
在最新推出的SYSMEX XE-2100 系列、XT-2000i/1800i 系列五分類血液分析中，半導(dǎo)體激光作為光源將光束照射在流式細(xì)胞室內(nèi)的白細(xì)胞，通過不同角度的散射光可以反映細(xì)胞外部的體積和內(nèi)部顆粒復(fù)雜程度的信息。其中側(cè)向信號(hào)用以反映細(xì)胞內(nèi)部信息（主要是顆粒的復(fù)雜性）。試劑中增加了特異性針對(duì)DNA/RNA 染色的熒光染料Polymethine( 聚次甲基染料) 。激光照射后產(chǎn)生熒光信號(hào)，和側(cè)向散射光一道繪制成二維散點(diǎn)圖進(jìn)行白細(xì)胞分類。
b. 幼稚白細(xì)胞分析的應(yīng)用
白細(xì)胞中的幼稚成份在臨床上具有顯著意義。過去，此類標(biāo)本主要依靠人工鏡檢。隨著血液分析儀檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，儀器對(duì)于幼稚白細(xì)胞的報(bào)警提示越來越靈敏。
通過一些特異性的化學(xué)手段，五分類儀器還可以進(jìn)行幼稚白細(xì)胞的定量檢測(cè)。SYSMEX XE/XT 系列采用核酸熒光染色后，根據(jù)細(xì)胞成熟度的不同可以體現(xiàn)在其熒光信號(hào)的強(qiáng)弱上，其白細(xì)胞分類通道出正常細(xì)胞分類外，還有兩個(gè)幼稚白細(xì)胞的定量參數(shù)： IG （幼稚粒細(xì)胞）和Other （原始細(xì)胞/ 異常淋巴）。臨床研究表明IG 可以作為感染性疾病、白血病、炎癥的有用參數(shù)，另外也提示治療的預(yù)后和療效監(jiān)測(cè)
2. 在紅細(xì)胞、血小板系分析的應(yīng)用
a. 光學(xué)染色法檢測(cè)PLT
通過光學(xué)技術(shù)，可以在一定程度上改善電阻抗原理僅僅判斷細(xì)胞體積所帶來的局限性，提高了紅細(xì)胞和血小板的準(zhǔn)確性。而現(xiàn)代生物染色技術(shù)的發(fā)展，使更加特異性的核酸染色法與光學(xué)技術(shù)結(jié)合成為可能。在SYSMEX XE-2100 、XT-2000i 血液分析儀上，檢測(cè)血小板的方法增添到兩種。儀器的紅細(xì)胞和血小板檢測(cè)通道采用鞘流電阻原理，常規(guī)標(biāo)本即以此為檢測(cè)手段。當(dāng)一些特殊標(biāo)本混有大型血小板或小球性紅細(xì)胞時(shí)，二者之中會(huì)有一部分具有相同的體積使電阻法無法準(zhǔn)確區(qū)分，儀器還可以使用光學(xué)染色法檢測(cè)(633nm 波長(zhǎng)的半導(dǎo)體激光束，染料為Plymethine 和Oxazine) 。血小板由于體積較小，但顆粒中存在有少量RNA ，被染料輕微著色而激發(fā)出熒光，此時(shí)得到的血小板結(jié)果更加可信。
b. 網(wǎng)織紅細(xì)胞分析
網(wǎng)織紅細(xì)胞是晚幼紅細(xì)胞脫核后與成熟紅細(xì)胞之間的過渡細(xì)胞，是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)。目前用自動(dòng)分析儀進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞分析的技術(shù)已經(jīng)取得很大進(jìn)展。隨著五分類儀器技術(shù)日臻發(fā)展， Sysmex XE-2100 、XT-2000i 具備了內(nèi)置式的全自動(dòng)網(wǎng)織紅檢測(cè)功能。采用激光流式原理和細(xì)胞核酸染色。除了進(jìn)行自動(dòng)的RET 數(shù)目和百分比計(jì)數(shù)外，還可以通過核酸染色得到的熒光信號(hào)強(qiáng)度區(qū)分低、中、高熒光強(qiáng)度的網(wǎng)織紅（ LFR 、MFR 、HFR ）。由于幼稚的網(wǎng)織紅熒光信號(hào)較強(qiáng)， MFR 和HFR 之和即反映未成熟網(wǎng)織紅的一個(gè)有用參數(shù)。
桂林優(yōu)利特公司研發(fā)的URIT系列五分類血細(xì)胞分析儀，全系產(chǎn)品具有網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)功能，提供網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)RET、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率RETIC和未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞值IRF三項(xiàng)參數(shù)。
c. 有核紅細(xì)胞分析
有核紅細(xì)胞作為幼稚的紅細(xì)胞在治療監(jiān)測(cè)和鑒別診斷時(shí)有重要臨床意義。而且，有核紅細(xì)胞體積與淋巴細(xì)胞相仿或略小，大多數(shù)儀器對(duì)這樣的標(biāo)本往往會(huì)誤計(jì)，這樣不但漏報(bào)了病理標(biāo)本，而且造成白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）結(jié)果假性升高。隨著五分類儀器的出現(xiàn)，儀器報(bào)警系統(tǒng)開始可以提示其存在的可能性，供操作人員鏡檢復(fù)核。
真正采用染色手段來自動(dòng)化地定量檢測(cè)有核紅細(xì)胞的功能，出現(xiàn)在SYSMEX XE-2100 和XE-2100L 上。XE-2100 儀器單獨(dú)設(shè)置檢測(cè)有核紅細(xì)胞的通道，特殊的溶血素將紅細(xì)胞完全破壞，有核紅細(xì)胞被裸核并收縮，而白細(xì)胞被保留。核酸熒光染色Polymethine 對(duì)標(biāo)本染色后，白細(xì)胞細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)核酸的染色總量遠(yuǎn)大于同樣被染色但被收縮的有核紅細(xì)胞，通過半導(dǎo)體激光照射后熒光信號(hào)和前向散射光信號(hào)均有區(qū)別。由此準(zhǔn)確計(jì)得有核紅細(xì)胞數(shù)目及占白細(xì)胞的比例。（作者:全國(guó)體外診斷網(wǎng)、南昌百特生物高新技術(shù)股份有限公司董事長(zhǎng): 練新廷；桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司執(zhí)行總裁: 鄭澤輝； 南昌百特生物高新技術(shù)股份有限公司高級(jí)工程師: 彭祝憲）
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