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HyTest
腦鈉肽（BNP）是公認(rèn)的心力衰竭標(biāo)記物，被廣泛應(yīng)用于心衰診斷和患者治療的臨床實(shí)踐中。
已知BNP是一個(gè)不穩(wěn)定的分子【2，3】。幾項(xiàng)近期的研究表明BNP在心衰患者血漿中有多種存在形式，它在N端和C端都可被截?cái)�，只有一小部分�?/font>BNP以全長(zhǎng)BNP32分子的形式存在【4】。大多數(shù)被銷(xiāo)售的BNP檢測(cè)系統(tǒng)都是夾心免疫檢測(cè)系統(tǒng)，使用兩株識(shí)別不同位點(diǎn)的單抗。至少其中的一株單抗識(shí)別環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一株通常識(shí)別BNP分子的C端。最新關(guān)于血液循環(huán)中BNP不穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)表明，在免疫檢測(cè)系統(tǒng)中如使用識(shí)別末端位點(diǎn)單抗，血液樣品中BNP的真正含量將有可能被低估。
HyTest的專(zhuān)家最近開(kāi)發(fā)了適用于新一代BNP檢測(cè)系統(tǒng)——"單抗原決定簇夾心免疫檢測(cè)系統(tǒng)（SES檢測(cè)系統(tǒng)）"的抗體。這種檢測(cè)系統(tǒng)不同于所有市場(chǎng)上"傳統(tǒng)"夾心BNP檢測(cè)系統(tǒng)【5】。在SES檢測(cè)系統(tǒng)中，捕獲抗體（單抗24C5，抗原決定簇11-17）通過(guò)結(jié)合到BNP分子相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)部分而捕獲抗原。檢測(cè)抗體只識(shí)別捕獲抗體和BNP（或proBNP）形成的復(fù)合物，不識(shí)別單獨(dú)的捕獲抗體或者BNP。因此，在這種新BNP檢測(cè)系統(tǒng)中，只需要一個(gè)BNP分子的抗原決定簇。這個(gè)特征使SES檢測(cè)系統(tǒng)更優(yōu)于傳統(tǒng)BNP檢測(cè)系統(tǒng)，因?yàn)檠簶悠分?/font>BNP的表象穩(wěn)定性明顯提高。
SES檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。為評(píng)估抗體和單抗原決定簇夾心檢測(cè)法的原理，我公司專(zhuān)家設(shè)計(jì)了一原始檢測(cè)系統(tǒng)，此一步檢測(cè)系統(tǒng)使用了生物素化捕獲單抗24C5和穩(wěn)定銪螯合物標(biāo)記的檢測(cè)單抗Ab-BNP2�？乖涂贵w同時(shí)在鏈酶親和素包被板上反應(yīng)35分鐘。SES檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)下限為0.4pg/ml（人工合成BNP，日本多肽研究所）。這是文獻(xiàn)中所報(bào)道的市場(chǎng)上和實(shí)驗(yàn)室BNP檢測(cè)系統(tǒng)的最高靈敏度。此SES BNP檢測(cè)系統(tǒng)的詳細(xì)描述已在近期發(fā)表【5】。
和BNP以及proBNP的相互作用。根據(jù)最新研究，患者血液中大部分的BNP免疫活性不是來(lái)自BNP，而是來(lái)自proBNP【1，6】。欲精確檢測(cè)樣品中BNP的免疫活性，抗體應(yīng)該能以相同的效率識(shí)別BNP和proBNP。
SES檢測(cè)系統(tǒng)能夠以同樣的效率識(shí)別表現(xiàn)BNP免疫活性的三種形式——BNP、未糖基化proBNP和糖基化proBNP（圖1）。經(jīng)心衰患者血漿樣品測(cè)試，SES BNP檢測(cè)系統(tǒng)適用于精確量化循環(huán)的BNP和proBNP分子。
圖1. SES檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別表現(xiàn)BNP免疫活性的不同抗原形式
三種不同抗原的校準(zhǔn)曲線(xiàn)：-■- 人工合成BNP，-■- 重組proBNP（糖基化，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)；本公司Cat.#8GOB2），-▲- 重組proBNP（未糖基化，大腸桿菌中表達(dá)）
抗原穩(wěn)定性研究。如上所述，BNP是一個(gè)極度不穩(wěn)定的分子，在人血液中很容易被內(nèi)源蛋白酶切割。但是在SES檢測(cè)系統(tǒng)中，所用抗體只需要單個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的中心抗原決定簇便可形成夾心復(fù)合體，與使用識(shí)別遠(yuǎn)距離位點(diǎn)抗體的普通夾心檢測(cè)系統(tǒng)相比，此方法檢測(cè)到的BNP有很高的表觀穩(wěn)定性。圖2為人工合成BNP和心衰患者血漿中內(nèi)源性抗原的穩(wěn)定性研究結(jié)果。穩(wěn)定性測(cè)定同時(shí)采用了SES檢測(cè)系統(tǒng)和傳統(tǒng)的使用識(shí)別遠(yuǎn)距離位點(diǎn)單抗的檢測(cè)系統(tǒng)（單抗50E126-32作為捕獲抗體，單抗24C511-17作為檢測(cè)抗體）。樣品在室溫下孵育不同時(shí)間段直至24小時(shí)。跟普通夾心檢測(cè)系統(tǒng)相比，人工合成抗原SES法檢測(cè)結(jié)果展示了較高的表觀穩(wěn)定性。24小時(shí)后，SES法仍可檢測(cè)到大約95%的BNP免疫活性，而普通夾心免疫檢測(cè)系統(tǒng)只能檢測(cè)到62%的BNP免疫活性。此外，當(dāng)把心衰患者血漿樣品孵育不同時(shí)間段后，SES法檢測(cè)到的內(nèi)源性多肽BNP表觀穩(wěn)定性也有提高。
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圖2. BNP穩(wěn)定性研究
（A）人工合成BNP（日本多肽研究所）重組于一正常人EDTA血漿中和（B）一心衰患者EDTA血漿在室溫（24℃）下孵育不同時(shí)間段。BNP免疫活性經(jīng)SES檢測(cè)系統(tǒng)（-■-）和傳統(tǒng)的識(shí)別遠(yuǎn)距離位點(diǎn)的單抗50E126-32 – 24C511-17 BNP檢測(cè)系統(tǒng)（-■-）測(cè)定。
心衰患者血漿中BNP檢測(cè)。通過(guò)用兩種BNP檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)心衰患者EDTA血漿樣品中BNP（BNP和proBNP）的免疫活性，再次證明了單抗原決定簇檢測(cè)系統(tǒng)相對(duì)于普通檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。94個(gè)心衰患者血漿樣品中的BNP濃度經(jīng)SES法和市場(chǎng)上的普通檢測(cè)系統(tǒng)西門(mén)子（Siemens）ADVIA Centaur BNP法測(cè)定。西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)使用了一株識(shí)別BNP分子C末端（抗原決定簇27-32）的單抗，和一株識(shí)別BNP分子環(huán)結(jié)構(gòu)（抗原決定簇14-21）的單抗【7】。兩種檢測(cè)系統(tǒng)都由大腸桿菌中表達(dá)的proBNP校準(zhǔn)。在所有的血漿樣品中，SES法檢測(cè)到的BNP濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西門(mén)子BNP法檢測(cè)到的濃度，從1.2到7.2倍不等，平均值為2.1倍（2.1±0.9）。7個(gè)血漿樣品（總樣品數(shù)94的7.4%）通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)所測(cè)得的BNP濃度比西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)所測(cè)結(jié)果高3到7.2倍。圖3為94個(gè)心衰患者血漿BNP檢測(cè)結(jié)果。
圖3. 94個(gè)心衰患者血漿樣品BNP檢測(cè)結(jié)果
BNP濃度通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)（綠色）和西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)（棕色）測(cè)定。SES檢測(cè)系統(tǒng)所測(cè)濃度比西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)所測(cè)濃度高3到7.2倍的樣品由紅色橢圓形標(biāo)出。
從圖3中可以看出，西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)低估了心衰患者血液中循環(huán)BNP的濃度。這個(gè)結(jié)果至少可以被解釋為：因?yàn)槲鏖T(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)使用了一株識(shí)別抗原決定簇27-32的單抗，所以不能識(shí)別C末端被截?cái)嗟?/font>BNP分子。我公司的SES檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于抗原講解的敏感度顯著降低，能夠檢測(cè)到各種有BNP免疫活性的形式：完整的和截?cái)嗟目乖�。因此�?/font>SES檢測(cè)系統(tǒng)是人血液中BNP完整定量的首選方法。
在急診室，只有準(zhǔn)確的BNP定量，才能正確診斷有心衰癥狀的患者。目前，心臟病專(zhuān)家使用特定的"排除法"（BNP<100pg/ml）和"歸入法"（BNP>400pg/ml）來(lái)進(jìn)行最正確的診斷【8】。圖4顯示了通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)和西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)所測(cè)得的4名患者BNP濃度差別。當(dāng)通過(guò)西門(mén)子BNP檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，這些患者（尤其是患者#4）有可能被錯(cuò)誤歸類(lèi)（不確定類(lèi)：濃度范圍100pg/ml到400pg/ml）從而被錯(cuò)誤診斷。而當(dāng)通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，同樣的患者毫無(wú)疑問(wèn)地屬于"確定"類(lèi)。這個(gè)例子證實(shí)了SES檢測(cè)系統(tǒng)更適合于BNP精確定量檢測(cè)。
圖4. 兩個(gè)BNP檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)4名心衰患者BNP濃度結(jié)果
BNP的濃度通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)（綠色）和西門(mén)子檢測(cè)系統(tǒng)（紅色）定量。當(dāng)被西門(mén)子BNP檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，這些患者可能被診斷為不確定性心衰（BNP濃度在100-400pg/ml范圍內(nèi)）。而當(dāng)通過(guò)SES檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，這些患者則被診斷為確定心衰（超過(guò)400pg/ml）。綠虛線(xiàn)為不確定區(qū)域或不確定心衰（100pg/ml）的下限，紅虛線(xiàn)為確定心衰（400pg/ml）的下限。
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