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近日，上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科李敏教授與汪驊教授團隊在國際知名學術(shù)期刊《Military Medical Research》（中科院一區(qū)，Top期刊，IF=22.9）發(fā)表題為《CRISPR-based assays for the detection of BK virus and JC virus infections post-kidney transplantation》的研究。該研究創(chuàng)新性地開發(fā)了一種名為ddCRISPR的雙靶標液滴定量檢測平臺，實現(xiàn)了對腎移植術(shù)后患者病毒載量的精準監(jiān)測；同時提出了一種基于試紙條的LFCRISPR檢測方法，為病毒的早期篩查及居家檢測提供了新思路。

腎移植術(shù)后，BK病毒（BKV）和JC病毒（JCV）感染是影響移植腎功能及威脅受者長期生活質(zhì)量的重要因素，因此對上述病毒進行早期檢測及術(shù)后監(jiān)測具有重要意義。然而，傳統(tǒng)檢測方法對實驗室條件、儀器設備及操作人員的專業(yè)水平要求較高，限制了其在基層醫(yī)療機構(gòu)的廣泛應用。研究團隊首先構(gòu)建了基于RPA-CRISPR/Cas13a的反應體系，實現(xiàn)了BKV和JCV的一鍋法檢測。進一步將該反應體系與雙通道液滴微流控芯片相結(jié)合，開發(fā)出一種新型雙靶標定量檢測方法（Dual-droplet microchip integrated with RPA-CRISPR, ddCRISPR）。實驗結(jié)果表明，該方法可分別檢測低至10拷貝/mL的BKV和1拷貝/mL的JCV，且兩種靶標之間具有良好的特異性及精準的定量檢測能力，初步滿足臨床檢測需求。

圖1 ddCRISPR檢測方法及性能驗證

為驗證ddCRISPR在臨床檢測中的實際應用效果，研究采用ddCRISPR與qPCR同步檢測125例來自腎移植患者及健康體檢者的血漿或尿液樣本。結(jié)果顯示，兩種檢測方法之間具有高度一致性與相關(guān)性。此外，研究還對一名接受腎移植手術(shù)的患者進行了為期半年的病毒載量動態(tài)監(jiān)測，并同步納入一項反映腎功能早期損傷的指標—尿白蛋白肌酐比（UACR）進行對比分析。結(jié)果表明，病毒載量變化趨勢與UACR變化趨勢基本一致，提示ddCRISPR不僅具備良好的定量檢測能力，還具有評估腎移植術(shù)后患者預后的潛力。

圖2. ddCRISPR用于實時監(jiān)測腎移植術(shù)后患者病毒載量

為助力腎移植術(shù)后患者病毒感染的早期篩查與居家檢測，本研究結(jié)合RPA-CRISPR/Cas13a一鍋法反應體系與測流層析試紙條技術(shù)，開發(fā)了一種名為Lateral Flow Strip integrated with RPA-CRISPR（LFCRISPR）的檢測方法。實驗結(jié)果顯示，該方法可檢測低至100拷貝/μL的BKV或JCV。在臨床樣本檢測中，LFCRISPR與qPCR檢測結(jié)果具有高度一致性。此外，該方法能夠有效區(qū)分陽性與陰性樣本，便于實現(xiàn)快速、可視化的結(jié)果判讀。

圖3. LFCRISPR檢測方法的建立和臨床樣本驗證

本研究第一作者為上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科碩士研究生劉宇，共同第一作者為仁濟醫(yī)院檢驗科碩士研究生徐靖嵩；通訊作者為仁濟醫(yī)院檢驗科汪驊教授、李敏教授、劉倩教授以及上海市臨床公共衛(wèi)生中心李順教授。研究工作得到了國家自然科學基金和上海交通大學醫(yī)工交叉項目的資助。未來，研究團隊將進一步拓展該檢測平臺在其他移植相關(guān)病毒及多種生物標志物檢測中的應用，推動移植患者術(shù)后感染的精準檢測與早期防控，為提升病原體快速檢測能力提供有力支撐。