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福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本是醫(yī)學(xué)研究和臨床病理診斷中不可或缺的生物資源庫。這些樣本能夠長期保存組織形態(tài)和細(xì)胞細(xì)節(jié)，且攜帶完整的臨床隨訪信息，為疾病機(jī)制研究、藥物開發(fā)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了寶貴材料。然而，傳統(tǒng)單細(xì)胞測序技術(shù)受限于FFPE樣本的RNA交聯(lián)、片段化及降解問題，難以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的單細(xì)胞分辨率分析。如何從這些“沉睡”的樣本中解鎖全轉(zhuǎn)錄組信息，一直是領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)難題。

針對(duì)FFPE樣本的固有挑戰(zhàn)，良渚實(shí)驗(yàn)室王永成團(tuán)隊(duì)歷時(shí)多年攻關(guān)，成功開發(fā)了snRandom-seq（Single-Nucleus Random-seq）技術(shù)。這一突破性方法通過整合隨機(jī)引物捕獲、原位反應(yīng)優(yōu)化和微流控液滴分選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了從FFPE樣本中高效分離單細(xì)胞核并構(gòu)建高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組文庫的目標(biāo)。相關(guān)內(nèi)容以“Single-nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded samples using snRandom-seq”為題發(fā)表在《Nature Protocols》上。 

snRandom-seq技術(shù)詳解

snRandom-seq的核心優(yōu)勢在于其獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和高效的樣本處理流程：

1

單細(xì)胞核分離

從FFPE樣本中精準(zhǔn)分離完整細(xì)胞核是測序的關(guān)鍵第一步。團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了組織消化和過濾流程，確保細(xì)胞核的高效提�。▓D1）。通過顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測，避免過度消化導(dǎo)致的核碎片化，最終獲得高純度的單細(xì)胞核懸液。

2

原位反應(yīng)與隨機(jī)引物捕獲

圖1：snRandom-seq原位反應(yīng)流程

在細(xì)胞核內(nèi)，利用隨機(jī)引物和寡聚dT引物的混合策略，全面捕獲mRNA和非編碼RNA。獨(dú)特的DNA阻斷技術(shù)有效排除基因組DNA污染，而3'端加A尾處理則為后續(xù)建庫奠定基礎(chǔ)。

3

微流控液滴建庫

單細(xì)胞核與含條形碼的微球在液滴中封裝，通過延伸反應(yīng)為每個(gè)細(xì)胞核賦予唯一標(biāo)識(shí)。最終通過PCR擴(kuò)增和測序文庫構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。

臨床應(yīng)用潛力

研究團(tuán)隊(duì)首次將snRandom-seq應(yīng)用于肺癌和膠質(zhì)瘤的FFPE樣本分析，取得了突破性成果：

肺癌研究

結(jié)合成像質(zhì)譜流式技術(shù)，揭示了原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了特定免疫微環(huán)境與免疫治療響應(yīng)的關(guān)聯(lián)。

膠質(zhì)瘤研究

在超過100例臨床樣本中，鑒定出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)亞型特征，并檢測到與預(yù)后相關(guān)的非編碼RNA標(biāo)志物。

技術(shù)優(yōu)勢與未來展望

與傳統(tǒng)方法相比，snRandom-seq具有以下顯著優(yōu)勢：

高靈敏度

兼容低質(zhì)量RNA樣本（DV200≥30%），減少樣本損耗。

全轉(zhuǎn)錄本覆蓋

同時(shí)捕獲mRNA、非編碼RNA及新生RNA，提供更全面的轉(zhuǎn)錄組信息。

低雙聯(lián)率

通過預(yù)索引策略將雙聯(lián)率控制在0.3%，提升數(shù)據(jù)可靠性。

未來，snRandom-seq有望擴(kuò)展至更多疾病領(lǐng)域，如神經(jīng)退行性疾病、自身免疫病等，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供強(qiáng)大的工具支持。

該研究由良渚實(shí)驗(yàn)室王永成研究員指導(dǎo)，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院徐子葉研究員、良渚實(shí)驗(yàn)室博士生呂樂筱、良渚實(shí)驗(yàn)室研究員陳海德為第一作者，研究獲國家自然科學(xué)基金（No. 32271421）、浙江省領(lǐng)軍創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（2021R52003）、中國航天員科研訓(xùn)練中心航天醫(yī)學(xué)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基金（No. SKL2024K04 ）和中國載人航天工程航天醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域項(xiàng)目（No. HYZHXMH03003）等資助。