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各區(qū)市場監(jiān)管局，房山區(qū)燕山市場監(jiān)管分局，市市場監(jiān)管局機場分局，經(jīng)開區(qū)商務(wù)金融局，市藥監(jiān)局各分局，各相關(guān)事業(yè)單位：
為深入貫徹落實醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管相關(guān)法規(guī)要求，進(jìn)一步規(guī)范北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查工作，持續(xù)強化醫(yī)療器械生產(chǎn)科學(xué)監(jiān)管，市藥監(jiān)局組織對《聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗實驗室檢查要點指南（2016版）》進(jìn)行了修訂，形成《北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗實驗室檢查指南（2024版）》，現(xiàn)印發(fā)給你們，請參照執(zhí)行。
特此通知。
北京市藥品監(jiān)督管理局
2024年12月6日
北京市聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗實驗室檢查指南（2024版）
聚合酶鏈反應(yīng)檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗實驗室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術(shù)，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過n個循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍，短時間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個特異靶DNA序列的復(fù)制，為預(yù)測、預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察和健康狀態(tài)評價提供了一種極有幫助的實驗室輔助手段。
PCR檢驗實驗室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則》條款中，對PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗環(huán)境做出明確規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對于PCR檢驗實驗室均作出規(guī)定，主要涉及《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）以及《實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)臨床實驗室 應(yīng)用指南》（WS/T 230-2024）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。
本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強對PCR檢驗相關(guān)過程的認(rèn)知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗實驗室設(shè)計建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗實驗室的設(shè)計建造和管理要求提供參考。
本指南中涉及或引用的國家相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章、標(biāo)準(zhǔn)、檢查指南等發(fā)生內(nèi)容或效力變化時，要以當(dāng)時執(zhí)行的最新版為準(zhǔn)。必要時，北京市藥品監(jiān)督管理局應(yīng)重新研究修訂，以確保本指南持續(xù)符合要求。
一、適用范圍
本檢查指南可作為北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)許可現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等涉及PCR檢驗實驗室檢查的參考資料。
基因測序檢驗實驗室等涉及PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢查指南執(zhí)行。
二、檢查要點
（一）PCR檢驗實驗室布局
生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供PCR檢驗實驗室設(shè)計方案和/或平面設(shè)計圖（應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度）。
1.PCR檢驗實驗室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接連通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。
2.原則上PCR檢驗實驗室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。若使用實時熒光定量PCR儀且不需要進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。合并的區(qū)域需采取相應(yīng)生物安全防護(hù)和避免環(huán)境污染的措施。
3.各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當(dāng)只是形式上的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。
4.各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接連通。擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機組方式的，PCR檢驗實驗室應(yīng)當(dāng)具備獨立空調(diào)機組；同時應(yīng)當(dāng)考慮停機后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。
5.按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的方式進(jìn)行，使得PCR檢驗實驗室的空氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向進(jìn)行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴增前的區(qū)域。空氣流向應(yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。PCR檢驗實驗室建設(shè)可參考附件進(jìn)行設(shè)計。
6.設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向?qū)嶒炇液妥呃鹊拈T應(yīng)當(dāng)安裝互鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個門同時打開的情況。
7.各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開門，要求密封嚴(yán)實，并且兩側(cè)的門應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施確保兩側(cè)門不會同時開啟。
（二）儀器設(shè)施配置
1.試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)的功能：儲存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的儲存和準(zhǔn)備。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
（1）符合儲存溫度要求的冰箱；
（2）混勻器；
（3）離心機；
（4）水浴箱或加熱模塊；
（5）微量加樣器；
（6）紫外消毒設(shè)備；
（7）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭；
（8）專用工作服和工作鞋（套）。
2.標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、儲存及加樣。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
（1）符合儲存溫度要求的冰箱；
（2）離心機；
（3）混勻器；
（4）水浴箱或加熱模塊；
（5）微量加樣器；
（6）紫外消毒設(shè)備；
（7）生物安全柜；
（8）核酸提取設(shè)備；
（9）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；
（10）專用工作服和工作鞋（套）；
（11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波設(shè)備。
3.擴增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：
（1）核酸擴增設(shè)備；
（2）微量加樣器；
（3）離心機；
（4）紫外消毒設(shè)備；
（5）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、耐高壓處理和（或）一次性的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；
（6）專用工作服和工作鞋（套）。
4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴增片段的進(jìn)一步分析測定。視檢驗方法不同而定，基本配置如下：
（1）分析設(shè)備；
（2）微量加樣器；
（3）紫外消毒設(shè)備；
（4）符合儲存溫度要求的冰箱；
（5）消耗品：一次性手套、一次性口罩、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；
（6）專用工作服和工作鞋（套）。
上述各區(qū)域儀器設(shè)備為一般配置，實驗室應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的擴增檢測技術(shù)或試劑的特點，對儀器設(shè)備進(jìn)行必要的增減。
5.設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)
應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程，計量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定或校準(zhǔn)。例如核酸擴增設(shè)備、微量加樣器等應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)工作。
（三）工作流程及注意事項
1.單次實驗進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。
2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。
3.不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。
4.實驗室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實驗垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。
5.工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔及消毒。
6.儲存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運送至試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)。應(yīng)當(dāng)對加樣吸頭、PCR反應(yīng)管等消耗品進(jìn)行防護(hù)，防止被污染。使用的試劑和耗材不應(yīng)當(dāng)對產(chǎn)品檢驗造成干擾。
7.加入待測核酸時，應(yīng)采取相應(yīng)的措施避免樣本間的交叉污染。對具有潛在傳染危險性的材料，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。
8.如需對擴增產(chǎn)物進(jìn)行開蓋處理的，應(yīng)當(dāng)采取相應(yīng)的措施避免氣溶膠所致的污染。
9.擴增產(chǎn)物分析區(qū)如存在溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等有毒有害物質(zhì)，應(yīng)當(dāng)注意實驗人員的安全防護(hù)，必要時配備通風(fēng)櫥等防護(hù)設(shè)備。
（四）人員培訓(xùn)情況
參與PCR檢驗的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識和技能，包括能熟練操作相關(guān)設(shè)備，明確整個工作的流程，掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實驗室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋。
檢查人員可以通過詢問或要求人員實際操作對其進(jìn)行評價，也可以通過查閱人員培訓(xùn)記錄，對其進(jìn)行評價。
（五）文件管理情況
結(jié)合實際建立對PCR檢驗實驗室的質(zhì)量管理體系文件，制定相關(guān)程序文件、操作規(guī)程等，并保留相應(yīng)記錄。相關(guān)質(zhì)量管理體系文件包括但不限于實驗室管理制度、人員管理制度、樣本管理制度、實驗室防護(hù)管理制度、廢棄物管理制度等，以及相關(guān)設(shè)施設(shè)備運行與維護(hù)操作規(guī)程、檢驗規(guī)程等。
在檢查過程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場查看、詢問、記錄的實際情況與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。
附件：1.理想的PCR檢驗實驗室設(shè)計
2.參考資料
附件1
理想的PCR檢驗實驗室設(shè)計
圖A 緩沖間為負(fù)壓的理想PCR檢驗實驗室設(shè)置模式
圖B 緩沖間為正壓的理想PCR檢驗實驗室設(shè)置模式
圖A和圖B所給出的PCR檢驗實驗室設(shè)置圖是較為理想的設(shè)置模式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計并建立實驗室。
附件2：
參考資料
1.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第64號）
2.《關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2015年第103號）
3.《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則等4個指導(dǎo)原則的通知》（食藥監(jiān)械監(jiān)〔2015〕218號）
4.全國臨床檢驗操作規(guī)程（第4版）
5.《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）
6.《實時熒光聚合酶鏈反應(yīng) 臨 床 實 驗 室應(yīng)用指南》（WS/T 230-2024）
7.《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》（GB 50346-2011）
8.《實驗室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）
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