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作者：周建　任雪梅　王馨　李卓

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710077）

引用本文：周建，任雪梅，王馨，等. CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的研究進(jìn)展和未來挑戰(zhàn)[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2024，39（6）：608-614.

摘要

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（Cas）系統(tǒng)是一種新興的分子診斷技術(shù)，具有檢測速度快、操作簡單、特異性高等優(yōu)勢，目前已成為分子診斷領(lǐng)域的研究熱點。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)中有一部分已得到臨床驗證，并獲得預(yù)期的結(jié)果，有望成為一種理想的核酸分子診斷技術(shù)，但其在臨床大規(guī)模應(yīng)用前尚有一系列問題需要解決。文章對已建立的CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的原理、特點和存在的問題進(jìn)行綜述，以期為CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列；成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白；分子診斷技術(shù)；核酸

目前，反復(fù)出現(xiàn)的各類傳染性疾病對分子診斷技術(shù)而言是嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。已有的分子診斷技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、數(shù)字PCR等具有特異性、靈敏度高等優(yōu)點，但存在檢測耗時長、成本較高、需要大量專業(yè)設(shè)備和檢測人員，以及較難實現(xiàn)即時檢測（point-of-care test，POCT）等不足。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）系統(tǒng)不但可以用于基因編輯，還可以用于分子診斷，尤其在核酸分子診斷過程中具有檢測速度快、設(shè)備便攜、成本低廉等優(yōu)點，因而被廣泛關(guān)注。然而，CRISPR/Cas系統(tǒng)在前期的臨床應(yīng)用中也出現(xiàn)了一系列問題。為此，本文擬對基于CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)的原理、特點、存在的問題和解決思路、方向進(jìn)行綜述，以期為CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的推廣應(yīng)用提供參考。

一、CRISPR/Cas系統(tǒng)分類

1987年，CRISPR/Cas在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，但直到2000年才被命名。依據(jù)效應(yīng)蛋白種類分為Class-Ⅰ和Class-Ⅱ 2個大類，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 6種類型，其中Class-Ⅱ類包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12/14、Ⅵ型的Cas13。2012年，JINEK等從鏈球菌中分離出spCas9蛋白，證明其具有識別和切割靶向DNA序列的能力。2015年，ZETSCHE等發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)具有能識別雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。隨著研究的深入，CRISPR/Cas系統(tǒng)的成員也逐漸豐富，其生物學(xué)功能，如基因編輯、分子診斷等也逐漸被開發(fā)利用。

二、可應(yīng)用于分子診斷的CRISPR/Cas類型

目前，可應(yīng)用于分子診斷的CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要類型有：Ⅱ型的代表CRISPR/Cas9、V型的代表CRISPR/Cas12/14和Ⅵ型的代表CRISPR/Cas13。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）可引導(dǎo)Cas9蛋白識別目標(biāo)DNA/RNA序列和原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），激活Cas9對雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的切割能力。CRISPR/Cas12/14系統(tǒng)可靶向識別DNA并激活其靶向切割和非靶向切割DNA的能力。CRISPR/Cas13系統(tǒng)中的Cas13蛋白在gRNA的引導(dǎo)下，可識別靶向RNA序列，激活其靶向和非靶向切割RNA活性。目前，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向識別以及特異性和非特異性切割核酸功能開發(fā)了一系列核酸檢測系統(tǒng)，其檢測策略見圖1。

三、CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的構(gòu)建策略

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)構(gòu)建核酸檢測系統(tǒng)的主要策略是聯(lián)合PCR、重組酶聚合酶等溫擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技術(shù)對靶向核酸序列進(jìn)行體外擴增，此過程提高了檢測的靈敏度，但增加了操作步驟、提高了被污染的風(fēng)險。因此，尚需對核酸檢測系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，建立一種無需擴增的CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)。見圖1。

3.1　基于CRISPR/Cas9構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)

基于Cas9蛋白的靶向識別和切割能力，PARDEE等構(gòu)建了依賴于LacZ開關(guān)和CRISPR/Cas9的核酸檢測系統(tǒng)——NASBA檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)的原理是通過CRISPR/Cas9靶向開啟或關(guān)閉LacZ基因的表達(dá)來實現(xiàn)核酸檢測，其檢測結(jié)果采用紙片傳感器讀取，可在3 h內(nèi)完成美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒的鑒定，實現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化讀取。其基本原理見圖1（a）。CRISPR/Cas9聯(lián)合電極芯片構(gòu)建的CRISPR-Chip檢測平臺是利用dCas9蛋白（指具有識別dsDNA的能力但是無切割dsDNA的活性的蛋白）高特異性靶向識別能力建立的檢測系統(tǒng)，可區(qū)分單堿基，已成功應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測，其基本原理見圖1（b）。CRISPR/Cas9聯(lián)合PCR構(gòu)建的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列分型聚合酶鏈反應(yīng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-typing polymerase chain reaction，ctPCR）是一種基于配對Cas9建立的核酸檢測系統(tǒng)，具有檢測耗時長和操作復(fù)雜等不足。因此，ZHANG等將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與定量PCR聯(lián)合，建立了ctPCR3.0系統(tǒng)，縮短了檢測時間，提高了檢測效率。Cas9n是HNH位點酶切功能失活，且具有切割dsDNA中1條鏈的能力的Cas9蛋白。ZHOU等基于pair Cas9n構(gòu)建了配對CRISPR/Cas9n開啟的核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換核酸擴增（CRISPR/Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification，CRISDA）技術(shù)，已成功應(yīng)用于SNP檢測。基于配對Cas9構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)的識別靶點為雙靶點，極大地提高了檢測的特異性，但也增加了反應(yīng)體系的復(fù)雜程度。總之，基于CRISPR/Cas9建立的核酸檢測系統(tǒng)可實現(xiàn)在30 min內(nèi)完成核酸檢測，檢測下限可達(dá)fmol·L^-1水平，且能可視化讀取結(jié)果。

3.2　基于CRISPR/Cas12構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)

3.2.1　基于熒光信號的Cas12核酸檢測系統(tǒng)

基于Cas12a建立的低成本高效的核酸檢測系統(tǒng)（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與PCR技術(shù)聯(lián)合，采用Cas12a識別靶向序列后非靶向切割熒光標(biāo)記的ssDNA，產(chǎn)生熒光信號并進(jìn)行檢測，但其需要2步才能完成檢測，易造成交叉污染；該系統(tǒng)目前已被用于檢測乙型腦炎病毒和DNA甲基化。鑒于HOLMES存在的不足，因此LI等開發(fā)了HOLMESv2檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)將Cas12b與LAMP技術(shù)聯(lián)合，實現(xiàn)了DNA擴增和Cas12b檢測的一步法，簡化了操作步驟，避免污染。SUN等建立了一步法DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR反式報告基因檢測系統(tǒng)，可在50 min內(nèi)完成H1N1甲型流感病毒的檢測，檢測下限可達(dá)1 拷貝·μL^-1。MUKAMA等將CRISPR/Cas12a/b與LAMP技術(shù)和側(cè)流生物傳感器聯(lián)合建立核酸檢測平臺，采用CRISPR/Cas12a/b識別靶向區(qū)域后，切割熒光標(biāo)記非靶向序列，并產(chǎn)生熒光信號，采用側(cè)流生物傳感器讀取信號，可在50 min內(nèi)完成銅綠假單胞菌核酸的檢測，檢測下限為1 拷貝·μL^-1。TENG等將CRISPR/Cas12b與RPA技術(shù)聯(lián)合后構(gòu)建的熒光信號核酸檢測系統(tǒng)對血漿人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的檢測下限可達(dá)1 amol·L^-1。WANG等基于Cas12a構(gòu)建的可視化熒光信號檢測平臺（Cas12a-based visual detection，Cas12aVDet）操作步驟少，顯著降低了污染的發(fā)生率，可在30 min內(nèi)完成支原體的檢測，并實現(xiàn)了檢測結(jié)果的可視化讀取�；�于LAMP-CRISPR/Cas12a的核酸檢測平臺實現(xiàn)了在紫外線燈下檢測大腸埃希菌核酸，且結(jié)果可視化�；�于CRISPR/Cas12側(cè)流生物傳感器（CRISPR/Cas12 lateral flow biosensor，CRISPR/Cas-LFB）制備的試紙條可在2 h內(nèi)完成非洲豬瘟病毒DNA的檢測，檢測下限可達(dá)1 fmol·L^-1�；�于CRISPR/Cas12構(gòu)建的熒光信號核酸檢測系統(tǒng)極大地提高了檢測靈敏度，縮減了檢測步驟，降低了污染率，尤其是CRISPR/Cas-LFB、Cas12aVDet等核酸檢測系統(tǒng)實現(xiàn)了可視化和POCT檢測，具有極大的推廣潛力。

3.2.2　基于電化學(xué)信號的Cas12a核酸檢測系統(tǒng)

DAI等構(gòu)建了基于CRISPR/Cas12a的電化學(xué)生物傳感器（CRISPR/Cas12a-based electrochemical biosensor，E-CRISPR）核酸檢測系統(tǒng)，他們將標(biāo)記有亞甲藍(lán)的非特異性ssDNA固定在金電極上，在gRNA的引導(dǎo)下，Cas12a識別靶向序列并非特異性切割固定在金電極上的ssDNA報告基因，引起電極芯片電信號的變化，實現(xiàn)目的基因的檢測。E-CRISPR核酸檢測系統(tǒng)可在30 min內(nèi)完成HPV和轉(zhuǎn)化生長因子-β1等的檢測。LIU等構(gòu)建了基于電化學(xué)發(fā)光信號（electrochemiluminescence，ECL）的核酸檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用Cas12a識別靶向序列后非靶向切割固定在載體上的金標(biāo)記的ssDNA復(fù)合體（SH-ssDNA-Fc/MetAuNC），從而產(chǎn)生電化學(xué)信號的變化，可在70 min內(nèi)完成HPV檢測，檢測下限為0.48 pmol·L^-1。ECL核酸檢測系統(tǒng)將CRISPR/Cas12系統(tǒng)與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合，提高了檢測靈敏度，為CRISPR/Cas12系統(tǒng)的臨床應(yīng)用提供了一種新的思路。

3.2.3　基于商品化早孕試紙的CRISPR/Cas12a核酸檢測系統(tǒng)

TANG等將商品化早孕試紙與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)聯(lián)合建立核酸檢測系統(tǒng)，主要部件包括Cas12a、菜花狀大型DNA組合體（cauliflower-like large-sized DNA assembly，CLD）、RPA、ssDNA-人絨毛膜促性腺激素結(jié)合探針（human chorionic gonadotropin conjugation probe，NHP）。基本檢測流程為RPA擴增目標(biāo)DNA，gRNA引導(dǎo)Cas12a識別靶向序列并非靶向切割NHP序列后，與早孕試紙結(jié)合、顯色，可在30 min內(nèi)完成HPV核酸檢測，檢測下限為2 拷貝·μL^-1。

總之，將CRISPR/Cas12系統(tǒng)與熒光信號、電化學(xué)信號和商品化試紙條結(jié)合，極大提高了檢測效率，簡化了操作，降低了檢測成本，尤其是與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合有效提高了檢測的靈敏度。然而，基于CRISPR/Cas12建立的核酸檢測系統(tǒng)也存在不足，如Cas12的脫靶效應(yīng)、需要擴增技術(shù)輔助等，這也限制了其商業(yè)化應(yīng)用。

3.3　基于CRISPR/Cas14的核酸檢測系統(tǒng)

CRISPR/Cas14具有對非靶向DNA的切割能力，基于這一特點，HARRINGTON等開發(fā)了Cas14-DETECTR核酸檢測系統(tǒng)，其基本流程為：對硫代磷酸標(biāo)記5'引物對靶向區(qū)域進(jìn)行體外擴增，獲得dsDNA后，采用T7核酸外切酶從5'到3'降解dsDNA或RNA、DNA中的一條鏈，獲得ssDNA，然后Cas14在gRNA的引導(dǎo)下，識別靶向序列并非靶向切割熒光標(biāo)記ssDNA，產(chǎn)生熒光信號，該系統(tǒng)可在2 h內(nèi)完成檢測下限達(dá)1 amol·L^-1水平的SNP檢測。CRISPR/Cas14是一類新型核酸酶，代表了一種新的檢測系統(tǒng)。

3.4　基于CRISPR/Cas13的核酸檢測系統(tǒng)

CRISPR\Cas13系統(tǒng)具有靶向切割RNA和非特異切割RNA的活性，因此學(xué)者們基于此特性建立了一系列核酸檢測系統(tǒng)，其基本原理見圖1（d）�；�于CRISPR/Cas13建立的核酸檢測系統(tǒng)的直接檢測靶標(biāo)為RNA序列，其檢測靶標(biāo)多樣，實現(xiàn)了多通道檢測，拓展了檢測的樣本類型，提高了臨床實用性。另外，CRISPR/Cas13可與電化學(xué)技術(shù)、手機軟件等結(jié)合，簡化了信號讀取方式，方便操作。然而，CRISPR/Cas13直接識別的靶標(biāo)為RNA，因此部分核酸檢測系統(tǒng)為了提高檢測的靈敏度，需要借助轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)實現(xiàn)RNA和DNA的轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行體外擴增，這增加了檢測的復(fù)雜性。

3.4.1　基于CRISPR/Cas13的單通道熒光信號核酸檢測系統(tǒng)

GOOTENBERG等基于CRISPR/Cas13a建立了單通道熒光信號檢測系統(tǒng)，即特異性高靈敏度酶解報告基因解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing，SHERLOCK）檢測系統(tǒng)，其由CRISPR/LwCas13a、RPA、逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和T7啟動子轉(zhuǎn)錄技術(shù)構(gòu)成。SHERLOCK檢測系統(tǒng)利用Cas13a識別靶向ssRNA，并非特異性切割熒光素標(biāo)記的ssRNA，產(chǎn)生熒光信號，可在2～5 h內(nèi)完成寨卡病毒和登革熱病毒檢測，檢測下限可達(dá)1 amol·L^-1。QING等將SHERLOCK系統(tǒng)與1種名為HUDSON的系統(tǒng)結(jié)合并建立核酸檢測平臺，采用37～50 ℃加熱5～20 min滅活核酸酶，64～95 ℃加熱5 min滅活病毒，一步法完成核酸檢測，可在2 h內(nèi)完成寨卡病毒核酸的檢測，極大地縮短了檢測時間，減少了操作步驟，降低了被污染率。LIU等將CRISPR/LbuCas13a與Csm6 RNA內(nèi)切酶結(jié)合建立了增強熒光信號的快速串聯(lián)集成核酸酶檢測（fast integrated nuclease detection in tandem，F(xiàn)IND-IT）平臺，并基于FIND-IT平臺建立了快速檢測新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸的方法，檢測時間為20 min，檢測下限為31拷貝·μL^-1，無需進(jìn)行核擴增。

3.4.2　基于CRISPR/Cas13的多通道熒光信號核酸檢測系統(tǒng)

基于CRISPR/Cas12系統(tǒng)和CRISPR/Cas13系統(tǒng)建立的4通道核酸檢測系統(tǒng)（SHERLOCKv2），是SHERLOCK檢測系統(tǒng)的優(yōu)化升級版，采用waCas13a、CcaCas13b、PsmCas13b和AsCas12a4 種酶實現(xiàn)了4 通道檢測， 其顯著提高了SHERLOCK系統(tǒng)的特異性，改善了結(jié)果讀取的局限性。Csm6與Cas13耦聯(lián)具有熒光信號放大的作用，可提高檢測的靈敏度。SHERLOCKv2檢測系統(tǒng)可在0.5～3 h內(nèi)完成寨卡病毒、金黃色葡萄球菌等的檢測。ACKERMAN等將CRISPR/Cas13a系統(tǒng)與PCR、RPA和微陣列芯片結(jié)合，開發(fā)了高通量病毒核酸檢測平臺——CARMEN/Cas13a，采用熒光成像系統(tǒng)記錄熒光信號，具有高通量、快速、低成本的優(yōu)點，一次可檢測169種與人類相關(guān)的病毒核酸，檢測下限可達(dá)1 amol·L^-1。CARMEN/Cas13a檢測平臺實現(xiàn)了多通道樣本檢測，顯著提高了檢測效率。

3.4.3　基于CRISPR/Cas13的電化學(xué)信號核酸檢測系統(tǒng)

ZHOU等將CARMEN/Cas13a與催化循環(huán)DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合，建立了基于電化學(xué)信號檢測的電化學(xué)RNA傳感技術(shù)芯片（COMETchip），可在36 min內(nèi)完成miRNA的檢測，檢測下限為50 amol·L^-1。FOZOUNI等將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與CARMEN/Cas13a結(jié)合，將核酸分子信號通過Cas13a轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號，構(gòu)建了基于特異性引物的電化學(xué)信號miRNA檢測平臺——PECL-CRISPR，可在30 min內(nèi)完成檢測，檢測下限可達(dá)1 fmol·L^-1。

3.4.4　基于手機讀取信號的CRISPR/Cas13核酸檢測系統(tǒng)

ARIZTI-SANZ等將CRISPR/LbuCas13a與手機顯微鏡技術(shù)結(jié)合，采用buCas13a識別靶向序列并非靶向切割熒光標(biāo)記核酸序列，從而產(chǎn)生熒光信號，采用手機顯微鏡檢測系統(tǒng)讀取熒光信號進(jìn)行檢測。該核酸檢測系統(tǒng)具有快速、成本低廉等特點，且不需要進(jìn)行核酸擴增。NGUYEN等建立了名為SHINE的核酸檢測系統(tǒng)，采用HUDSON系統(tǒng)滅活SARS-Cov-2 10 min，在同一個反應(yīng)體系中完成反應(yīng)，5 min內(nèi)用手機APP軟件讀取熒光信號，敏感性為90%，特異性為100%，平均反應(yīng)時間為50 min。

四、CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的特點和未來面臨的挑戰(zhàn)

4.1　樣本前處理問題

基于CRISPR/Cas構(gòu)建的核酸檢測系統(tǒng)中有少數(shù)檢測系統(tǒng)將樣本前處理與核酸檢測過程合并，雖然解決了樣本處理的問題，但仍存在核酸純度低，導(dǎo)致檢測效率低的不足。為了提高檢測效率，大部分CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)將樣本處理和檢測過程分為兩步完成，首先采用傳統(tǒng)方法提純核酸，然后采用CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)進(jìn)行靶標(biāo)檢測，此策略增加了操作步驟，亦增加了污染的風(fēng)險。因此，CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)未來面臨的挑戰(zhàn)之一是優(yōu)化樣本前期處理流程，實現(xiàn)樣本處理與檢測過程的合并（圖1）。

4.2　CRISPR/Cas系統(tǒng)與輔助技術(shù)的聯(lián)合問題

在基于CRISPR/Cas的核酸檢測過程中，為了實現(xiàn)對DNA和RNA靶標(biāo)檢測的靈活性，必須借助于轉(zhuǎn)錄技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)DNA與RNA的轉(zhuǎn)化；同時，為了提高檢測的靈敏度，需借助PCR、RPA和LAMP等輔助技術(shù)對目標(biāo)序列進(jìn)行擴增，以提高靶向核酸序列的濃度。然而，聯(lián)合輔助技術(shù)檢測顯著增加了檢測成本、檢測時長和操作步驟等。基于CRISPR/Cas的核酸檢測過程存在一個關(guān)鍵難題，一步法CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)操作步驟少，可有效減少污染，但核酸擴增和CRISPR/Cas在同一個反應(yīng)體系中，擴增底物模板為CRISPR/Cas識別和切割的靶向序列，在擴增過程中CRISPR/Cas會同時切割模板序列，導(dǎo)致擴增模板損失，影響了擴增效率，尤其是CRISPR/Cas12檢測系統(tǒng)可非特異性切割擴增引物，從而抑制擴增，極大地影響了擴增效率。兩步法CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)雖能有效解決以上問題，但卻增加了操作步驟和被污染的風(fēng)險。因此，一步法和兩步法各有弊端，還有待優(yōu)化檢測策略，其中最優(yōu)化的方案見圖1，期望在未來的研究中能解決一步法和兩步法CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)面臨的問題。

4.3　CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的通量問題

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR/Cas系統(tǒng)迎來了新的挑戰(zhàn)，其中之一就是通量問題。目前，臨床需要檢測的靶標(biāo)分子種類和數(shù)量越來越多，如何提高檢測通量是CRISPR/Cas系統(tǒng)未來面臨的挑戰(zhàn)之一。雖然CARMEN/Cas13a平臺可一次性檢測169種與人類相關(guān)的病毒基因，但該平臺未經(jīng)大樣本量的臨床驗證，且操作復(fù)雜，檢測成本高，尚無法應(yīng)用于臨床。因此，CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)需進(jìn)一步優(yōu)化，提高檢測通量和檢測效率，并進(jìn)行大規(guī)模臨床驗證，這也是CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)未來需要解決的重要問題。

4.4　CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的信號讀取問題

隨著臨床診斷要求的不斷提高，需要檢測的靶標(biāo)分子種類不斷增多，因此需建立更豐富的針對不同靶標(biāo)的CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)，以滿足臨床對復(fù)雜樣本靶標(biāo)檢測的需求。目前，CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的信號讀取方式也在不斷改進(jìn)，如熒光信號、電化學(xué)信號、側(cè)流生物傳感器、商業(yè)品化試紙條，極大地改善了傳統(tǒng)單一的信號讀取方式。見圖2。

4.5　Cas蛋白的脫靶效應(yīng)問題

CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，在未來的研究中需優(yōu)化CRISPR/Cas系統(tǒng)，降低其脫靶效應(yīng)，以降低檢測結(jié)果的假陽性。這也是CRISPR/Cas系統(tǒng)未來面臨的挑戰(zhàn)之一，其解決策略包括：1）尋找獲得高保真的Cas蛋白，優(yōu)化gRNA序列，優(yōu)化反應(yīng)體系溫度以及Cas蛋白和gRNA的比例，盡量降低脫靶效應(yīng)；2）CRISPR/Cas識別靶點序列依賴于PAM，這限制了檢測靶標(biāo)的靈活性，因此需尋找無PAM限制的Cas蛋白，以提高檢測靶標(biāo)的靈活性。

五、總結(jié)與展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種新興的核酸檢測方法具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ�其在病原體核酸檢測方面表現(xiàn)出色，一定程度上可以彌補傳統(tǒng)核酸檢測方法的不足，有望成為理想的分子診斷方法。不同CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)的特點見表1，CRISPR/Cas系統(tǒng)與傳統(tǒng)PCR的比較見表2。然而，CRISPR/Cas系統(tǒng)本身也存在一定的不足，如脫靶效應(yīng)和檢測靶標(biāo)的靈活性不足。同時，CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)也處于難以商品化的困境：1）一步法檢測效率較低，兩步法雖然提高了檢測的靈敏度，但也增加了操作的復(fù)雜性，增加了污染的風(fēng)險；2）缺少高效的高通量檢測系統(tǒng)和臨床大規(guī)模的驗證。這也是CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)商品化亟待解決的問題。另外，將CRISPR/Cas核酸檢測系統(tǒng)與人工智能聯(lián)合可以顯著提高檢測效率，實現(xiàn)可視化的POCT檢測，更好地服務(wù)于臨床。

參考文獻(xiàn)（略）