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呼吸道病原學檢測標本的采集方法
標本的運送、儲存與預(yù)處理
1．標本運送和儲存原則：
(1）標本標簽準確且申請單信息完整，應(yīng)將標簽貼在容器上，而非容器蓋上[13,14]；
(2）嚴格無菌操作[7]；
(3）盡快送檢標本，應(yīng)在采樣后2 h內(nèi)送達實驗室，樣本量少的標本應(yīng)于30 min內(nèi)送檢，避免標本干涸[7,15]；
(4）對一些特定的病原體，應(yīng)選擇合適的方法對標本進行保存和運送，并及時進行檢測。不同病原體檢測標本的采集和轉(zhuǎn)運原則見表2，不同類型標本采集量、保存和轉(zhuǎn)運時間見表3。
2．針對不同病原體的檢測方法：
標本采集后應(yīng)及時進行質(zhì)量控制，合格的標本應(yīng)盡可能短期內(nèi)送檢。在臨床工作中，除了常規(guī)檢驗外，還應(yīng)結(jié)合患者的病史、臨床表現(xiàn)、化驗結(jié)果和影像學檢查，有針對性地選擇合適的檢測方法對某些病原體進行檢測。當臨床預(yù)期和檢測結(jié)果不相符時，應(yīng)注意排除標本保存不當和檢測方法選擇錯誤等方面的因素。某些特殊病原體標本的轉(zhuǎn)運、保存和檢測方法見表4。
呼吸道病原檢測方法的優(yōu)缺點
病原檢測結(jié)果的判讀及其臨床價值
病原學檢查結(jié)果對臨床治療策略的選擇具有指導(dǎo)意義，陰性結(jié)果有助于判斷是否停用抗菌藥物。病原學檢查結(jié)果的判讀應(yīng)該綜合考慮患者的年齡、基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài)、臨床特點、病情嚴重程度以及先期的抗感染治療等情況。
(一）直接抗原快速檢測
(二）血清特異性抗體檢測
(三）涂片
所獲取的各種標本均應(yīng)行病原學涂片檢查。非侵入性檢查獲得的標本必須為合格標本，不合格標本常存在上呼吸道定植菌污染。在結(jié)果判讀時，需要結(jié)合患者的臨床癥狀和影像學表現(xiàn)，排除操作過程或環(huán)境污染的可能。BALF離心沉淀后行六胺銀染色、抗酸染色和革蘭染色可分別用來檢測肺孢子菌、分枝桿菌和部分細菌等。肺穿刺標本和胸腔積液涂片發(fā)現(xiàn)病原體對確診具有重要意義。
1．細菌：
2．分枝桿菌：
痰涂片萋-尼抗酸染色和熒光染色法是診斷開放性肺結(jié)核的主要手段，但涂片鏡檢所見的抗酸桿菌并不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，熒光涂片鏡檢的敏感度高于萋-尼染色[44]。
3．真菌：
4．寄生蟲：
涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)寄生蟲蟲體、蟲卵、滋養(yǎng)體、包囊或卵囊可作為確診依據(jù)。直接涂片鏡檢可發(fā)現(xiàn)并殖吸蟲蟲卵、阿米巴原蟲滋養(yǎng)體，吉姆薩染色可發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲滋養(yǎng)體或包囊，改良抗酸染色可發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲卵囊，改良三色染色法可發(fā)現(xiàn)比氏微孢子蟲[13,47]。
(四）培養(yǎng)
在進行痰培養(yǎng)前必須確定是合格痰標本，并排除操作不當或環(huán)境污染的情況。定量培養(yǎng)有助于區(qū)分致病菌和定植菌。
1．細菌：
(1）痰定量培養(yǎng)的細菌濃度≥107 cfu/ml、經(jīng)氣管內(nèi)吸取物細菌培養(yǎng)濃度≥105 cfu/ml、BALF培養(yǎng)細菌濃度≥104 cfu/ml或保護性毛刷標本細菌培養(yǎng)濃度≥103 cfu/ml時，致病菌的可能性較大[48,49,50]；
(2）胸腔積液、肺活檢標本培養(yǎng)到病原菌[13]，下呼吸道標本培養(yǎng)出支氣管炎博德特菌、土拉熱弗朗西斯菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌可作為確診依據(jù)[37]。
2．分枝桿菌：
培養(yǎng)結(jié)果可鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，并有利于體外藥敏試驗。但結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)耗時長、操作復(fù)雜，對實驗室生物安全要求較高，應(yīng)結(jié)合核酸檢測如GeneXpert檢測結(jié)果進行判斷[44,51]。
3．非典型病原體：
下呼吸道標本分離培養(yǎng)陽性可以確診，但耗時長，陽性率偏低，通常通過血清特異性抗體、核酸檢測等方法診斷。
4．呼吸道病毒：
標本進行細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)或培養(yǎng)細胞表面出現(xiàn)血細胞凝集抗原提示病毒陽性。但因其培養(yǎng)耗時長，陽性率偏低，不建議常規(guī)應(yīng)用，多通過血清特異性抗體、核酸檢測等方法診斷[36]。
5．真菌：
(五）核酸分子擴增檢測和基因芯片檢測
與傳統(tǒng)方法相比較，核酸分子擴增和基因芯片檢測具有以下優(yōu)勢：
(1）方法簡單、快速、高效，敏感度和特異度均較高，能為臨床早期診斷提供依據(jù)，尤其對一些需要長時間培養(yǎng)（如結(jié)核分枝桿菌）或無法體外培養(yǎng)（如病毒）的病原體，更適合采用分子診斷技術(shù)進行檢測。在新近發(fā)生的新型冠狀病毒肺炎疫情中，實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性已經(jīng)作為確診病例的病原學診斷標準之一[35,54]。
(2）目前的分子診斷技術(shù)可以一次性檢測多種病原體，有助于快速篩查病原。
(3）目前研發(fā)的耐藥基因檢測有助于制定臨床決策[55,56,57]。
但分子檢測技術(shù)也存在不足：
(1）多重PCR使用多對引物同時擴增時，可能出現(xiàn)引物間相互干擾，影響其敏感度和特異度，造成假陰性或假陽性；
(2）核酸檢測陽性結(jié)果需結(jié)合臨床實際情況，分析究竟是定植菌還是致病菌。
目前，我國自主研發(fā)的環(huán)引物介導(dǎo)的等溫擴增微流控芯片體系，有機結(jié)合了核酸分子擴增和基因芯片技術(shù)，應(yīng)用加樣后自動封閉式的獨立分隔多重擴增，在提高診斷率的同時，降低和避免了常規(guī)核酸擴增引起污染的可能，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床病原的檢測[58]。
(六）16S rRNA基因測序和宏基因組測序
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