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編者按：Journal Club是本刊開設(shè)的專門討論和分享最前沿檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)成果的板塊，旨在通過精選并分享高質(zhì)量的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，幫助讀者及時獲取檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿動態(tài)和科學(xué)發(fā)現(xiàn)。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展受相關(guān)調(diào)控通路中驅(qū)動基因集合（包括KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA在內(nèi)）的共同影響，患者中攜帶有這四種驅(qū)動基因突變者約占40%~70%。隨著靶向新療法和最小殘留病灶治療策略的發(fā)展，對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行基因突變檢測和長期監(jiān)測的臨床需求日益突顯。在選用分子診斷技術(shù)時，除考量基本檢測性能外，也更趨向于靈活、便捷、無創(chuàng)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

數(shù)字PCR具有出色的檢測靈敏度和特異性，在難以獲得癌癥組織或監(jiān)測最小殘留病灶的情況下，可利用液體活檢標(biāo)本中的微量檢材對突變進(jìn)行準(zhǔn)確評估。但如何提升數(shù)字PCR的多重檢測能力、擴(kuò)大靶標(biāo)通量，是限制其在臨床診治中廣泛實(shí)施的一個瓶頸。

近年來，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科團(tuán)隊(duì)致力于液體活檢檢測技術(shù)的方法創(chuàng)新與改進(jìn)。團(tuán)隊(duì)在2023年發(fā)表于《The Journal of Molecular Diagnostics》雜志（IF 4.1，JCR 2區(qū)）的研究工作中，基于多重drop-off數(shù)字PCR技術(shù)（multiple drop-off digital PCR，MDO-dPCR）針對結(jié)直腸癌開發(fā)出了解決靶標(biāo)通量痛點(diǎn)的檢測新方法。

01

/ 數(shù)字PCR檢測新方法設(shè)計(jì)

在該項(xiàng)工作中，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)字PCR檢測方法的靈敏度與特異性，將基于振幅/比率的多重檢測策略與drop-off檢測策略相結(jié)合，最終僅以3個檢測反應(yīng)實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、全面地篩查KRAS/MRAS/BRAF/PIK3CA基因上69種常見熱點(diǎn)突變。其低成本、高分析性能及高覆蓋度的優(yōu)勢鮮明，在對大量臨床可操作突變進(jìn)行全面檢測的同時，最大限度地減少了患者標(biāo)本的使用量需求，尤其適用于在液體活檢樣本量有限的情況下篩查突變。與二代測序技術(shù)相比，周轉(zhuǎn)時間更快、成本更低，能勝任有限資源情況下關(guān)鍵預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的快速篩選，有力支持臨床治療決策。

圖1  多重drop-off數(shù)字PCR（MDO-dPCR）檢測的設(shè)計(jì)和優(yōu)化

該項(xiàng)研究將常規(guī)dPCR、單靶和雙重drop-off策略靈活結(jié)合，分別設(shè)計(jì)了三種MDO-dPCR方案，分別用于KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因的熱點(diǎn)突變檢測。圖1為探針設(shè)計(jì)原理及二維散點(diǎn)示意圖。

單靶標(biāo)反應(yīng)（Simplex）展示了野生型基因組DNA（WT）和相應(yīng)熱點(diǎn)區(qū)域突變質(zhì)�；旌衔铮∕UT）經(jīng)drop-off探針檢測后的熒光信號簇分離情況。在drop-off策略下，每個探針使用兩種不同熒光基團(tuán)（FAM/HEX）分別標(biāo)記突變熱點(diǎn)區(qū)域的野生型序列（DO探針）及其相鄰的不變區(qū)域序列（REF探針）。這樣野生型序列所形成的單個擴(kuò)增子可釋放雙陽性熒光信號（橙色）；當(dāng)熱點(diǎn)區(qū)域存在突變時，DO探針失去結(jié)合或呈次優(yōu)結(jié)合，其FAM或HEX信號呈較低熒光振幅，表現(xiàn)為單陽性熒光信號（綠色或藍(lán)色）。

在設(shè)計(jì)多重靶標(biāo)反應(yīng)的過程中（Multiplex），研究團(tuán)隊(duì)加入對探針濃度或熒光比的調(diào)節(jié)，影響不同靶標(biāo)熒光信號的相應(yīng)振幅/比率，產(chǎn)生二維坐標(biāo)中一系列可分離辨識的獨(dú)特?zé)晒庑盘柎亍?/span>

02

/ 臨床隊(duì)列研究評估診斷性能

圖2  MDO-dPCR與Firefly NGS方法對結(jié)直腸癌患者隊(duì)列血漿游離DNA突變檢測的結(jié)果比較

研究使用合成寡核苷酸對MDO-dPCR方法的檢測性能進(jìn)行了評估，證實(shí)其具有高度特異性，分析靈敏度<0.2%，達(dá)到了篩選低起始量樣品所需的靈敏度水平。同時利用結(jié)直腸癌患者隊(duì)列（n=106）的血漿cfDNA樣本就MDO-dPCR與NGS方法檢測結(jié)果進(jìn)行了比較（圖2）。106例患者個體經(jīng)兩法檢測后92例結(jié)果相符，一致性達(dá)86.79%（圖2A）。在隊(duì)列中所有患者合計(jì)1060個可報(bào)告結(jié)果中，40個突變陽性結(jié)果和1003個突變陰性結(jié)果經(jīng)兩法同時檢出，另外17個不一致的突變結(jié)果均處在低突變等位基因頻率（mutant allelic frequency，MAF）水平，其中位MAF為0.63%，范圍為0.26%~2.17%（圖2B）。兩法除顯示出高度的結(jié)果一致性外，所檢出MAF也顯示出較強(qiáng)的相關(guān)性（圖2C），兩法平均MAF差異為2.77%（圖2D）。

郭瑋教授點(diǎn)評

該項(xiàng)研究工作展示了一種全面的MDO-dPCR檢測設(shè)計(jì)思路，對于KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA中常見熱點(diǎn)突變的檢測僅利用3個反應(yīng)就顯示出了優(yōu)越的分析性能，也經(jīng)過臨床隊(duì)列研究證實(shí)了其臨床有效性。

與NGS檢測相比，MDO-dPCR的報(bào)告速度更快、成本更低，在資源有限的臨床環(huán)境下也能快速支持治療決策。它在開發(fā)策略上具有高度的通用性，適用于更廣泛的臨床場景。

郭瑋

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科主任

郭瑋，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科主任，博士、博士生導(dǎo)師、教授。長期從事腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)機(jī)制及檢驗(yàn)新技術(shù)研究，揭示肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶釋放到循環(huán)內(nèi)生存新機(jī)制�，F(xiàn)任中國醫(yī)師協(xié)會檢驗(yàn)醫(yī)師分會副會長、中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會常務(wù)委員、上海市醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)�？品謺�候任主任委員、上海市醫(yī)學(xué)會理事，《中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》和《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)》副主編。

近年來主持國家自然科學(xué)基金4項(xiàng)，參與完成“十二五”國家科技支撐計(jì)劃子課題、國家科技重大專項(xiàng)課題多項(xiàng)，榮獲2020年國家科技進(jìn)步二等獎（參與）、2022年上海市科委臨床檢驗(yàn)質(zhì)譜專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺、2019年度上海市科學(xué)技術(shù)獎一等獎（參與）、2019年度華夏醫(yī)學(xué)科技獎，獲2020年度“國之名醫(yī)・優(yōu)秀風(fēng)范”榮譽(yù)稱號。獲得國家專利授權(quán)41項(xiàng)。在國內(nèi)外統(tǒng)計(jì)源期刊發(fā)表論文190余篇，以第一作者或通訊作者在Clinical Cancer Research、J Hematol Oncol、Clinical Chemistry、Hepatology Research、BMC Cancer等雜志上發(fā)表SCI 90余篇。主編、參編專著20部。