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蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的功能，了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對于闡明其功能和設(shè)計(jì)靶向藥物至關(guān)重要。人們通常使用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）光譜學(xué)和電子顯微鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但這些方法耗時(shí)長、技術(shù)難度大、成本高且適用性差。為此，科研人員開發(fā)了從頭預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法——AB Initio，利用基于物理的算法從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但其無法表征更大、更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。

近年來，機(jī)器學(xué)習(xí)算法的快速發(fā)展顯著提高了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的速度，該領(lǐng)域最顯著的成就之一是DeepMind開發(fā)的AlphaFold 2（AF2）模型，其基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可從氨基酸序列中預(yù)測基態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，耗時(shí)短并具有較高的準(zhǔn)確性，為藥物發(fā)現(xiàn)和基礎(chǔ)研究開辟了新的道路、對人類健康產(chǎn)生了顯著影響。但一系列研究發(fā)現(xiàn)，AF2算法在預(yù)測替代蛋白質(zhì)構(gòu)象和序列變異影響方面能力有限。

近期，美國布朗大學(xué)分子和細(xì)胞生物學(xué)與生物化學(xué)系的科研人員在Nature Communications上發(fā)表了題為“High-throughput prediction of protein conformational distributions with subsampled AlphaFold2”的文章。研究團(tuán)隊(duì)提出了一種使用AlphaFold 2通過亞采樣多序列比對直接預(yù)測不同蛋白質(zhì)構(gòu)象相對種群的創(chuàng)新方法，并對兩個(gè)具有截然不同可用序列數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)進(jìn)行核磁共振實(shí)驗(yàn)，即Abl1激酶和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），該方法以超80%的準(zhǔn)確率預(yù)測了相對狀態(tài)種群的變化。此外，亞采樣方法在用于定性預(yù)測突變或進(jìn)化對蛋白質(zhì)構(gòu)象分布和高密度狀態(tài)的影響時(shí)效果最好。綜上，該方法高效、迅速且成本較低，能有效預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)象的相對種群，甚至可達(dá)到單點(diǎn)突變的分辨率，有望成為藥理學(xué)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和預(yù)測進(jìn)化的有用工具。

文章發(fā)表在Nature Communications

亞采樣AF2工作流程

近年來，已有多個(gè)研究小組觀察到，采用不同參數(shù)和多序列比對（MSA）深度的AF2方法能歐僅基于序列數(shù)據(jù)預(yù)測構(gòu)象變化，這些替代AF2框架的共同原理是對MSA進(jìn)行亞采樣，以調(diào)節(jié)不同結(jié)構(gòu)域的協(xié)同進(jìn)化信號(hào)。從主MSA中隨機(jī)選擇任意數(shù)量的序列（由max_seq參數(shù)定義）（目標(biāo)序列始終被選中），其余序列使用Hamming距離圍繞每個(gè)選定序列聚類；AF2使用聚類中心和聚類中長度為extra_seq的樣本進(jìn)行推斷（圖1）。先前工作表明，在默認(rèn)值的基礎(chǔ)上顯著降低max_seq值和extra_seq值，可實(shí)現(xiàn)對一系列模型系統(tǒng)的集成預(yù)測。

圖1：AF2的MSA聚類啟發(fā)式算法。

基于上述觀察結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)測試了不同AF2參數(shù)組合預(yù)測Abl1激酶核心結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。據(jù)悉，Abl1有三種不同的主要構(gòu)象：在溶液中，Abl1主要以活動(dòng)（基態(tài)）狀態(tài)存在，在極少數(shù)情況下會(huì)轉(zhuǎn)換為非活性狀態(tài)1（I1），然后轉(zhuǎn)換為非活性狀態(tài)2（I2）；從基態(tài)到I1狀態(tài)的變化較小，但從I1到I2狀態(tài)的轉(zhuǎn)變涉及到相當(dāng)大的骨架重排。

為使用AF2生成完整的Abl1構(gòu)象集合，研究團(tuán)隊(duì)首先通過JackHMMR算法在野生型Abl1激酶核心（殘基229-515）上編譯了一個(gè)涵蓋60萬條序列的廣泛MSA；為提高結(jié)果的統(tǒng)計(jì)能力，為每個(gè)測試運(yùn)行了32個(gè)具有獨(dú)立種子的預(yù)測，并在推斷過程中啟用了dropout，以便從模型的不確定性中取樣；所有其他參數(shù)保留默認(rèn)設(shè)置。

結(jié)果顯示，當(dāng)max_seq：extra_seq值為256：512時(shí)，激活環(huán)構(gòu)象的結(jié)果最為多樣化；重要的是，AF2預(yù)測的激活環(huán)構(gòu)象集合分布于Abl1從基態(tài)到I2態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中。為進(jìn)一步檢驗(yàn)AF2是否真正預(yù)測了沿轉(zhuǎn)變過程的構(gòu)象，研究團(tuán)隊(duì)將160個(gè)AF2 Abl1的亞采樣預(yù)測集合與從溶液中apo Abl1的增強(qiáng)采樣分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬生成的I1到I2軌跡中提取的代表性快照進(jìn)行比較，這一比較的代表性結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，AF2成功預(yù)測了Abl1激酶基態(tài)的相對種群；激活環(huán)轉(zhuǎn)變的覆蓋范圍較大，表明使用AF2對中間狀態(tài)進(jìn)行采樣，有可能揭示其路徑和機(jī)制。

圖2：通過Abl1激酶核心的增強(qiáng)采樣MD模擬和代表性AF2預(yù)測得到的I1、I2軌跡比較。

接下來，研究團(tuán)隊(duì)研究了AF2在無下游MD模擬的情況下預(yù)測構(gòu)象分布的潛力。已知野生型Src激酶占據(jù)基態(tài)的頻率顯著高于Abl1，如果亞采樣AF2的假設(shè)是正確的，該方法將輸出基態(tài)Src比基態(tài) Abl1顯著更多的預(yù)測。為此，研究團(tuán)隊(duì)使用與Abl1相同的流程為Src激酶核心（殘基235-497）序列構(gòu)建了一個(gè)大的MSA，并將其作為輸入運(yùn)行亞采樣AF2，檢測了Src激酶核心基態(tài)和I2態(tài)的相對種群。

結(jié)果顯示，絕大多數(shù)來自亞采樣AF2的Src激酶核心預(yù)測都處于基態(tài)，預(yù)測的相對狀態(tài)種群為97%，而Abl1為89%。有趣的是，Src預(yù)測中沒有一個(gè)被發(fā)現(xiàn)處于I2狀態(tài)，這表明在使用AF2預(yù)測相對狀態(tài)種群時(shí)存在分辨率限制：在目前的實(shí)現(xiàn)中，具有較低占用率的構(gòu)象（如Src中的I2）可能會(huì)被算法遺漏。雖然存在分辨率問題，但亞采樣AF2正確地預(yù)測了Abl1和Src激酶核心之間構(gòu)象分布的差異，這證明了其作為預(yù)測相對狀態(tài)種群的高通量方法的前景。研究團(tuán)隊(duì)還使用亞采樣AF2方法對Anc-AS激酶核心（殘基1-263）進(jìn)行預(yù)測，并將結(jié)果與Abl1和Src病例進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，預(yù)測的Anc-AS有93%的時(shí)間處于基態(tài)，介于Src（97%）和Abl1（89%）的預(yù)測頻率之間，與預(yù)期結(jié)果一致。

蛋白質(zhì)中的許多點(diǎn)突變被認(rèn)為可通過改變構(gòu)象和相對狀態(tài)種群從而導(dǎo)致不同的表型（如耐藥性），為此研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用亞采樣AF2對一系列Abl1單突變體和雙突變體進(jìn)行預(yù)測，這些突變體對基態(tài)和I2狀態(tài)的相對種群有明顯的特征和顯著影響。結(jié)果顯示，亞采樣AF2準(zhǔn)確預(yù)測了相對狀態(tài)種群及其方向的變化，準(zhǔn)確率超80%。

圖3：亞采樣AF2預(yù)測沿Src到Abl1進(jìn)化途徑和Abl1耐藥突變的蛋白質(zhì)非基態(tài)構(gòu)象百分比。

考慮到對Abl1預(yù)測的成功，研究團(tuán)隊(duì)試圖檢驗(yàn)?zāi)芊裼酶�少的序列�?shù)據(jù)獲得類似的預(yù)測結(jié)果，并使用人類GMCSF的序列重復(fù)了上述預(yù)測流程（圖4）。GMCSF是一種分子量為14 kDa的單體糖蛋白，在先天性免疫中發(fā)揮核心作用，可刺激多種細(xì)胞對病原體做出應(yīng)答。GMCSF中N端螺旋A的動(dòng)態(tài)變化可形成兩種構(gòu)象：一是封閉構(gòu)象（基態(tài)），這是晶體堆積時(shí)最穩(wěn)定的GMCSF構(gòu)象；二是開放構(gòu)象，可與肝素和其他免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行結(jié)合。

圖4：該研究預(yù)測的兩個(gè)蛋白質(zhì)系統(tǒng)的構(gòu)象集合。

研究團(tuán)隊(duì)使用野生型人類GMCSF序列作為查詢和JackHMMR方法構(gòu)建了MSA（112個(gè)序列）后，確定了導(dǎo)致GMCSF構(gòu)象最大多樣性的max_seq和extra_seq參數(shù)，并預(yù)測了野生型GMCSF的結(jié)構(gòu)。為評估突變?nèi)绾斡绊慓MCSF的構(gòu)象分布，研究團(tuán)隊(duì)檢測了每個(gè)預(yù)測的GMCSF結(jié)構(gòu)的特定主鏈原子位置的RMSD（圖5）。

結(jié)果顯示，亞采樣AF2方法準(zhǔn)確預(yù)測了突變體H15/83和H87骨架重排幅度的差異；與H87的突變相比，H15和H83的突變在構(gòu)象分布方面引起的變化更大；并正確估計(jì)了突變體H83R和H83N對c端構(gòu)象的顯著影響，同時(shí)準(zhǔn)確預(yù)測了H83N、H83Y和H87三種突變體對殘基80-90 RMSD分布的影響。特別地，研究團(tuán)隊(duì)還在GMCSF中發(fā)現(xiàn)了一種與基態(tài)和開放態(tài)顯著不同的替代構(gòu)象A1，在該替代構(gòu)象中，C螺旋與B螺旋交換了位置，螺旋B占據(jù)了與肝素結(jié)合的凹槽。

圖5：GMCSF突變的亞采樣AF2結(jié)果。

綜上所述，對于Abl1激酶，亞采樣AF2定性預(yù)測突變了對激酶核心活性狀態(tài)種群的積極和消極影響，以及激酶核心活性到非活性轉(zhuǎn)變中的大多數(shù)激活環(huán)中間狀態(tài)；對于GMCSF，該方法預(yù)測了其構(gòu)象集合在響應(yīng)點(diǎn)突變時(shí)的變化，揭示亞采樣AF2解碼構(gòu)象變化信號(hào)的卓越能力�？傊�，這些結(jié)果突出了AF2在預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化方面的強(qiáng)大且尚未開發(fā)的潛力，這將對生物物理學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。

論文原文：

Monteiro da Silva, G., Cui, J.Y., Dalgarno, D.C. et al. Author Correction: High-throughput prediction of protein conformational distributions with subsampled AlphaFold2. Nat Commun 15, 3089 （2024）. https://doi.org/10.1038/s41467-024-47504-0

來源：測序中國