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血常規(guī)復檢規(guī)則是保證血常規(guī)結(jié)果準確的重要方法，是實現(xiàn)血常規(guī)自動審核的基礎(chǔ)。每個實驗室必須制定并驗證適合的血常規(guī)復檢規(guī)則并嚴格按照復檢規(guī)則執(zhí)行復檢。許多漏檢病例的出現(xiàn)，就是因為檢驗人員對復檢規(guī)則不夠重視，或是血細胞形態(tài)學識別能力不足。
眾多實驗室的復檢規(guī)則，都是參考國際血液學復檢專家組推薦的41條血常規(guī)復檢規(guī)則，并根據(jù)自己實驗室的實際情況所制定出來的。詳見往期推文：檢驗人必須掌握的血常規(guī)N個復檢規(guī)則！
同時，除了這41條篩檢規(guī)則外，采用不同的血細胞分析系統(tǒng)，建立與各自醫(yī)療單位和服務(wù)人群相適應(yīng)的復檢規(guī)則也成為了一項重要的工作，這也是實驗室管理辦法和ISO 15189評審中重要的檢查條款。
在應(yīng)用各種血液細胞自動化分析設(shè)備時，復查和復檢很重要，我們應(yīng)該從下面幾點進行復查或者復檢，及時發(fā)現(xiàn)問題。
重視樣本性狀的篩查
進行血細胞分析復檢時，首先應(yīng)該關(guān)注標本的性狀非常重要。明顯影響檢測結(jié)果的問題包括：標本采集量是否符合要求，血液標本凝集或有凝塊，乳糜血或脂血，冷凝集現(xiàn)象或冷球蛋白，溶血，高白細胞血癥，高膽紅素血癥等。
1.標本采集量：
如果使用真空采血管，采用真空采血模式，一般不會出血采集量差異太大的情況。但遇到抽血困難，或許有采集量不足問題。此時應(yīng)與臨床溝通，確認檢驗結(jié)果是否受到影響，如果沒有受到影響，采用讓步檢驗的模式發(fā)放報告，并備注說明采集量問題。如果用注射器采集后注入采血管內(nèi)，會發(fā)生采集量不準，過少或者過多。過多時可能造成抗凝劑與血液比例不適，導致抗凝不充分，從而影響血小板及其他指標的檢測結(jié)果，此時應(yīng)做不合格標本處理。
2.凝血標本：
通過肉眼觀察可以發(fā)現(xiàn)標本已經(jīng)凝血；搖動試管可以發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)有大小不同的凝塊；打開試管帽可見管帽內(nèi)存有凝塊；用長竹簽或施工攪動標本或吸取，用于發(fā)現(xiàn)肉眼沒有發(fā)現(xiàn)的凝塊或纖維蛋白凝絲。此類標本可判定為不合格，應(yīng)予拒收退回。
3.乳糜血或脂血：
通過自然沉淀或離心沉淀，可發(fā)現(xiàn)乳糜血（圖1），乳糜血會導致光學法檢測的HGB測定結(jié)果不正確，進而影響MCH，MCHC計算結(jié)果，此時需采用離心置換血漿的模式排除干擾后再行測定HGB，或者采用光學法原理的儀器或功能測定HGB結(jié)果，并重新評估和計算MCH，MCHC。高脂血癥肉眼不可發(fā)現(xiàn)，可通過LIS系統(tǒng)查詢生化檢測結(jié)果，再查看WBC分類散點圖，評估分類結(jié)果是否正確，必要時應(yīng)采用顯微鏡分類法糾正白細胞分類結(jié)果。
4.冷凝集及冷球蛋白：
嚴重的冷凝集現(xiàn)象肉眼可見試管壁出現(xiàn)細沙樣顆粒（圖2），弱冷凝集時可將標本置于4°C冰箱環(huán)境下3-5min，即可肉眼發(fā)現(xiàn)，也可將少許標本滴于玻片上在顯微鏡下查看。冷凝集現(xiàn)象可導致紅細胞測定結(jié)果偏低，進而導致MCH，MCHC計算錯誤，MCV測定不準確，兼而影響WBC計數(shù)不準確。應(yīng)首先采用37°C水浴30~60min之后再行測定的方式解決。冷球蛋白極難發(fā)現(xiàn)，往往導致PLT結(jié)果假性升高，通過血涂片和散點圖異�？沙醪桨l(fā)現(xiàn)，最終需要通過免疫固定電泳或毛細管免疫分型結(jié)果來確定。此時PLT結(jié)果不可輕易發(fā)放，或許要經(jīng)37°C水浴30~60min之后再行測定，排除冷球蛋白干擾。
5.溶血：
將標本離心可發(fā)現(xiàn)是否有溶血現(xiàn)象，如有溶血則可作為不合格標本拒收。
6.高白細胞血癥：
白血病患者白細胞往往會升高至100×109/L以上，一般認為當白細胞數(shù)量>200×109/L時會導致比色法HGB測定結(jié)果不正確，嚴重貧血患者甚至還會影響到RBC檢測結(jié)果的準確，進而影響MCH，MCHC計算結(jié)果的正確。將標本沉淀一段時間就可以看到紅細胞層與血漿之間出現(xiàn)明顯的白細胞沉淀層（圖3）�？赏ㄟ^HGB、RBC、HCT之間的關(guān)系和MCH、MCHC的結(jié)果綜合判定分析，確認該血常規(guī)結(jié)果是否符合規(guī)則，一旦影響應(yīng)減除白細胞數(shù)量對紅細胞的影響以及HGB受到的濁度干導致的錯誤，進行糾正后再發(fā)報告。高白細胞血癥（特別是中性粒細胞）還可影響血糖檢測結(jié)果，導致其降低[10]，應(yīng)及時與科室負責血糖檢測的同事進行溝通交流。
7.高膽紅素：
高膽紅素可通過沉淀或離心法，觀察血漿顏色進行初判，更可通過LIS系統(tǒng)查閱血清Bil測定結(jié)果后判定。高膽紅素時會導致比色法的HGB結(jié)果偏高，進而導致MCH、MCHC計算結(jié)果不準確，也可通過這兩個計算參數(shù)的異常來評估標本是否受高膽紅素影響而導致偏高。如遇到此問題，可采用置換血漿的方法重新測定HGB結(jié)果，并糾正HCH、MCHC計算結(jié)果。
8.其他：
包括標本采集錯誤，無條碼或標簽、標簽脫落、試管破裂、試管蓋未蓋緊導致標本滲漏等問題，應(yīng)予以拒收。
顯微鏡涂片復檢
血涂片的復檢與復核方法有兩種，血片瀏覽（review）和血片分類（differential）。許多情況下我們僅僅需要瀏覽復核血片，用于確認血細胞分析儀得出的結(jié)論，例如紅細胞體積大�。▽Πl(fā)現(xiàn)的紅細胞異常形態(tài)、染色、內(nèi)含物應(yīng)同時進行描述和報告），大小不等、某類細胞增高或減低（不包括形態(tài)學報告內(nèi)容）。對出現(xiàn)白細胞形態(tài)學提示的問題，分類不正確的問題、不能分類的問題，則應(yīng)采用顯微鏡下血片分類，重新分類報告。
那么復檢規(guī)則要關(guān)注和解決哪些問題呢？以下幾點建議供參考：
1.首先瀏覽血涂片，此時可采用低倍（或高倍）鏡瀏覽觀察，初步了解血涂片制片效果，細胞的分布情況，染色效果，有否具有病理意義的大型細胞的出現(xiàn)等。如果是EDTA抗凝血，血小板應(yīng)該分布均勻，不應(yīng)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，如有出現(xiàn)明顯的血小板聚集現(xiàn)象，特別是在玻片的兩端和尾部出現(xiàn)大片凝集時（圖4），將是導致儀器法計數(shù)血小板假性減低的重要原因，也是復檢時首先要關(guān)注的問題，也是檢驗科最不應(yīng)該漏檢的內(nèi)容。觀察血片同時還需要觀察紅細胞的分布與排列，發(fā)現(xiàn)緡錢狀排列現(xiàn)象和紅細胞凝集現(xiàn)象等，從而發(fā)現(xiàn)初步判斷是否有多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、血粘度較高或者冷凝集綜合征等，甚至考慮判斷是否會影響紅細胞計數(shù)的準確性等問題。
2．通過血涂片的瀏覽觀察，可以對血細胞分析儀測定的細胞計數(shù)結(jié)果進行復核，初步評估儀器計數(shù)結(jié)果的可靠性和一致性。例如白細胞可參考表1的關(guān)系進行復核[4]；或采用估算方法進行復核，選擇血片中分布均勻的區(qū)域進行評估，白細胞計數(shù)（×109/L）=每高倍鏡視野中白細胞平均個數(shù)×2×109/L[5]。
還可根據(jù)血涂片上血小板分布情況初步評估儀器對血小板計數(shù)結(jié)果的一致性及復核。如果每油鏡視野中平均1個血小板，相當于PLT計數(shù)結(jié)果的10×109/L，依次類推。或者通過血片推斷血小板數(shù)量，選擇血片體尾交界處分布均勻、無異常聚集或纖維蛋白絲的區(qū)域，瀏覽血涂片可大致估算血小板數(shù)量，方法為：血小板數(shù)（×109/L）=每油鏡視野中血小板平均個數(shù)×15×109/L[5]。
3.復檢中很重要的問題是不要漏檢血液系統(tǒng)疾�。▓D5、圖6），特別是血液系統(tǒng)腫瘤。雖然許多品牌的血細胞分析儀可以給出不成熟粒細胞（IG）、異型淋巴細胞（ATYP）、原始細胞（BLAST）、核左移（LEFT SHIFT）、大型未染色細胞（LUC）等提示性報警信息，甚至是數(shù)量結(jié)果信息，但是他們依然具有局限性。根據(jù)目前的技術(shù)水平，五分類原理的血細胞分析儀尚不能對多種異常細胞給出明確的定義，更談不上對血液系統(tǒng)疾病給出正確的白細胞分類報告。因此需要有經(jīng)驗的檢驗醫(yī)師或技師進行細致的顯微鏡分類復檢。我們在進行顯微鏡涂片檢查時，除了關(guān)注和發(fā)現(xiàn)各系原始或幼稚細胞外，此外還應(yīng)關(guān)注白細胞內(nèi)的顆粒變化，如多顆粒中性粒細胞和少（乏）顆粒中性粒細胞；中性粒細胞毒性改變，如中毒顆粒（也稱多顆粒中性粒細胞）、空泡變性、Döhle小體及白細胞體積大小不均等；核左移與核右移；Pelger-Huet畸形(圖7)、May-Hegglin畸形、Chediak-Higashi畸形、是否吞噬病原微生物等現(xiàn)象。這些問題的出現(xiàn)對診斷傳染性疾病、某些嚴重感染、中毒、惡性腫瘤、猩紅熱、白喉、MDS等具有重要意義，還對疾病的治療和預(yù)后判斷具有一定的幫助。對嗜酸性、嗜堿性和單核細胞異常增高的病例，也需進行鏡下復核與確認，以防止出現(xiàn)假性增加的問題。此外還要觀察是否有其他異常細胞出現(xiàn)，如異型淋巴細胞、漿細胞、骨髓瘤細胞、毛細胞、塞色利（Sezary）細胞（圖8）、淋巴瘤細胞等，以便初步篩查某些血液系統(tǒng)疾病。白細胞參數(shù)出現(xiàn)異常報警提示，一般要考慮進行顯微鏡下的白細胞分類，將幼稚或異常的白細胞給出適當?shù)陌俜直葓蟾�，對儀器分類錯誤的結(jié)果要給予糾正或重新分類確定。如果某些報警信息過于敏感，經(jīng)鏡檢確認未見異常報警信息所提示的細胞、或未見異常細胞，也要在報告中予以記錄和說明。
4.應(yīng)該關(guān)注紅細胞形態(tài)信息，提供貧血診斷的初步鑒別信息。一般血細胞分析儀都會提供許多紅細胞報警的信息，如大細胞（Macro）、小細胞（Micro）、紅細胞大小不等（Aniso）、血紅蛋白含量不均（HC VAR）、低色素性（Hypo）、高色素性（Hyper）等形態(tài)學信息。作者認為這些紅細胞形態(tài)學信息是更加準確的告知一個樣本的紅細胞大小或大小不等的信息，他更加客觀、更加敏感，更加準確的、定量化的了解紅細胞大小及色素改變的情況，是比較可信的參數(shù)，而這些參數(shù)的準確性應(yīng)該建立在儀器校準合格、儀器質(zhì)控在控及MCV\MCH\MCHC三項浮動均值指標完全在控的基礎(chǔ)之上。而人工觀測和描述這些紅細胞信息，則可能受到個人經(jīng)驗因素影響，作者認為其敏感性和一致性不如儀器分析結(jié)果準確和穩(wěn)定。紅細胞大小及形態(tài)學改變的臨床意義參見表2。
紅細胞分析還可對一些現(xiàn)象進行提示性報警，如紅細胞聚集（RBC Agglutination）表示標本可能有冷凝集現(xiàn)象；HGB測定渾濁增加（HGB Interf）則可能是因乳糜血因素的影響；有核紅細胞增加（NRBC）、紅細胞雙峰分布（Dimorphic Pobulation）、紅細胞碎片（RBC Fragment）干擾等，這些提示可以對一些紅細胞和血紅蛋白異常現(xiàn)象進行初步判斷，但是NRBC、紅細胞聚集、紅細胞碎片現(xiàn)象等還需要進行顯微鏡下的確認。如果這些現(xiàn)象出現(xiàn)，會影響到白細胞和紅細胞計數(shù)的正確性，進而影響紅細胞相關(guān)計算參數(shù)的準確性，因而需復檢血片；紅細胞碎片增多會干擾阻抗法的血小板計數(shù)結(jié)果，也要通過儀器直方圖和散點圖初篩，通過復檢血片而確認，并且需要對受到影響的計數(shù)結(jié)果進行糾正。我們復檢血片所需要關(guān)注的是許多紅細胞形態(tài)的異常改變、染色情況和內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常時，血細胞分析儀的有關(guān)參數(shù)和報警信息不能完全覆蓋或不能正確提示，如珠蛋白生成障礙性貧血和HbC時出現(xiàn)的靶形紅細胞；遺傳性橢圓形紅細胞增多癥；自身免疫性溶血性貧血時的球形紅細胞（spherocyte）增多（圖9）；肝臟疾病、溶血性貧血和小兒消化系統(tǒng)疾病導致的口形紅細胞（stomatocyte）增加（圖10）；舞蹈病和重度肝損傷時的棘形紅細胞（acanthocyte）增多（11）、骨髓纖維化時的淚滴樣紅細胞（tear drop）、巨幼細胞貧血和橢圓形紅細胞增多癥時的橢圓形紅細胞（elliptocyte）增加（圖12）；以及鐮狀細胞（sickle cell）貧血、嗜堿性點彩（basophilic stippling）紅細胞、卡波環(huán)（Cabot rings）和豪焦小體（Howell-Jolly bodies）等情況出現(xiàn)和增加，均需要通過觀察紅細胞形態(tài)而進行識別和參與臨床輔助診斷。
2015年，國際血液學標準委員會（International Council for Standardization in Haematology，ICSH）根據(jù)十多位專家的研究和建議，推出了有關(guān)紅細胞形態(tài)術(shù)語的標準化和外周血細胞形態(tài)學特征分級標準(ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features)，見表3。該項推薦標準對今后應(yīng)用細胞形態(tài)術(shù)語的標準化，特別是在判斷細胞形態(tài)異常的標準方面，提供了有價值的借鑒性指導[6]。其中有關(guān)紅細胞形態(tài)的術(shù)語和分類原則，與我國專業(yè)書籍或教科書中有關(guān)紅細胞形態(tài)的命名及分類原創(chuàng)有一定差距，這方面應(yīng)該引起我國同行們的注意。同時筆者也建議國內(nèi)檢驗學會和血液學專家盡快討論，制定或建立中英文標準化術(shù)語和譯名，規(guī)范化各種細胞類別的定義，這對專業(yè)的發(fā)展是有積極意義的。
5.特別關(guān)注血小板，血小板體積小，易發(fā)生聚集和計數(shù)不準，因此是非常容易出現(xiàn)問題的復檢內(nèi)容之一。在進行血涂片檢查或復檢時，首要注意是否出現(xiàn)血小板聚集（PLT Clump）報警信息，或者血小板分布異常（PLT Abn Distribution）的提示，特別是應(yīng)用EDTA抗凝血標本時，注意防范血小板假性減低現(xiàn)象發(fā)生。而EDTA抗凝劑導致的假性血小板減低會給臨床帶來誤診或延誤治療。此外還需要關(guān)注大血小板是否明顯增加的報警（Large PLT），它會使阻抗法計數(shù)的血小板出現(xiàn)假性減低現(xiàn)象，此時需要考慮是否改用其他檢測原理的設(shè)備，或者改用顯微鏡計數(shù)法進行糾正，巨、大血小板出現(xiàn)過多甚至會導致儀器“漏數(shù)”，這些超出紅細胞體積大小的巨、大血小板只有通過鏡檢才能發(fā)現(xiàn)（圖13）。外周血出現(xiàn)較多顆粒缺失或減少的血小板、巨大血小板、形態(tài)異常的血小板、血小板體積明顯大小不等，對骨髓病態(tài)造血相關(guān)的疾病和凝血機能障礙的疾病具有提示意義，如骨髓增生異常綜合征、慢性骨髓增生性疾病等。此外作者在最近的兩年中還發(fā)現(xiàn)了冷球蛋白血癥患者，導致血小板計數(shù)假性升高的病例，如果是假性升高到極高的水平（如>1000×109/L）通過我們的復檢規(guī)則還可以發(fā)現(xiàn)，如果是血小板偏低，而假性升高到正常水平，甚至儀器不出現(xiàn)任何報警信息，那則是非常難以發(fā)現(xiàn)和復檢查出的，可間接通過鏡檢血涂片，注意發(fā)現(xiàn)紅細胞之間的不規(guī)則形的蛋白凝聚形成的凝固痕跡，同時評估血小板數(shù)量與儀器計數(shù)結(jié)果是否符合，如果不符合，特別是儀器計數(shù)結(jié)果顯著增高，可以懷疑為冷球蛋白現(xiàn)象的干擾。我們在2013和2015年就發(fā)現(xiàn)兩例此類患者。因此發(fā)現(xiàn)冷球蛋白血癥，其血小板計數(shù)結(jié)果一定要經(jīng)過人工復檢來確認，這是以前的復檢規(guī)則中未曾提到的問題[7]。
6.血片檢查中另一特別需要重視的問題是血液寄生蟲，某些患者可能因臨床癥狀不典型，未引起臨床醫(yī)生關(guān)注寄生蟲感染問題。我們在血液中可以發(fā)現(xiàn)瘧原蟲[8]、微絲蚴、巴貝斯蟲、錐蟲、弓形蟲等感染，要知道這些病原體的發(fā)現(xiàn)，實際上是給臨床出具了診斷性報告，是血液檢驗中可以發(fā)出確診報告的項目，這是非常重要的。如果臨床病人有相關(guān)癥狀，或臨床醫(yī)生提示檢查血液寄生蟲，應(yīng)將血片仔細瀏覽，或者多涂幾張血片，包括厚血片進行細致檢查。而目前在南方，特別是從疫區(qū)國家歸來的人員，其瘧原蟲感染率非常高，值得警惕和仔細檢查。
復檢有時候還需要傳統(tǒng)的顯微鏡法予以配合，雖然血細胞分析儀在計數(shù)的準確性、精密度上、檢測速度上已經(jīng)大大高于傳統(tǒng)的人工測定方法，是毋庸置疑的。但是在某些特定的病例上，可能還需要人工法予以驗證和輔助分析。假如遇到EDTA及枸櫞酸鈉抗凝劑均可引發(fā)血小板聚集的病例，就需要回歸顯微鏡計數(shù)法。遇到嚴重的冷凝集現(xiàn)象或者冷球蛋白血癥、紅細胞碎片增加的病例，都有可能導致紅細胞計數(shù)及血小板計數(shù)出現(xiàn)錯誤，都可能要回歸顯微鏡計數(shù)法予以解決。溶血性貧血患者過高的網(wǎng)織紅細胞，也可因儀器試劑或線性問題導致計數(shù)結(jié)果偏低或不正確，且在41條規(guī)則中并未涉及到此類問題的復檢規(guī)則，因此也需要用傳統(tǒng)的煌焦油藍染色和顯微鏡計數(shù)法予以糾正[9]。
重復和復查
在41條復檢規(guī)則中也多次提到重復和復查，并用重測標本、稀釋標本后重新測定、替代方法計數(shù)、按實驗室SOP進行等。這是觸發(fā)某條規(guī)則后，需要實驗室采用復查、稀釋標本復查或其他方法進行驗證與確認。
重測標本：當遇有相關(guān)問題時，可采用重測標本的方式確認，最好用另一臺儀器，甚至另一品牌或不同原理的儀器進行重復，將有助于發(fā)現(xiàn)問題（前提是實驗室內(nèi)儀器均應(yīng)進行室內(nèi)比對并符合比對要求）。
稀釋標本后重新測定：當計數(shù)結(jié)果超出實驗室設(shè)定的線性范圍時，應(yīng)采用稀釋后測定的方法獲得更加準確的結(jié)果。推薦用儀器配套的鞘液或稀釋液進行定量稀釋，記住稀釋比以便計算最終結(jié)果。
替代方法計數(shù)：實驗室應(yīng)確認采用傳統(tǒng)計數(shù)方法對儀器不能準確測定的某些標本進行核實和計數(shù)。實驗室應(yīng)該制訂適當?shù)腟OP，并準備適當?shù)钠鞑暮驮噭�。作者建議實驗室內(nèi)血小板稀釋液、白細胞稀釋液、煌焦油藍染液等應(yīng)該是首選必備的試劑（圖17）。
圖像法設(shè)備的輔助復檢
目前已經(jīng)有數(shù)字圖像的血細胞檢查系統(tǒng)，這些數(shù)字圖像設(shè)備甚至可以配置到血細胞分析儀流水線上，全自動運行。系統(tǒng)會按照實驗室制訂的復檢規(guī)則存入系統(tǒng)，當樣本觸發(fā)復檢規(guī)則后，設(shè)備可自動將血液運輸?shù)酵科旧O(shè)備，制作一個標準的血涂片。再將血涂片置于自動顯微鏡下進行數(shù)字圖像拍攝，然后數(shù)字識別軟件對白細胞進行分類處理。其完全模擬顯微鏡分類技術(shù)進行形態(tài)學血細胞檢查，這是一個有益的進步。
但是可能還有一些瓶頸問題尚未得到解決，或許因血細胞形態(tài)千變?nèi)f化，在原始和幼稚細胞、異常細胞形態(tài)等方面，在某些成分的干擾情況下，其正確識別率仍有待進一步的提升。目前對應(yīng)用此類儀器應(yīng)用，作者的建議是，首先進行屏幕審核，糾正其錯誤識別的細胞，消除干擾成分，對難以鑒別的樣本，重新進行顯微鏡下的觀察和判別。
目前在廣泛應(yīng)用各種品牌的自動化血細胞分析儀進行大量血常規(guī)標本檢測的背景下、在工作量增加、檢驗人員配備不足、檢驗報告時間被限定的現(xiàn)實條件下，制定適合自己實驗室使用的、能夠保證實驗質(zhì)量、盡量減少漏檢和實驗誤差的復檢規(guī)則，非常重要。更為重要的是有了復檢規(guī)則、應(yīng)該具體落實和執(zhí)行這些規(guī)則，不要流于形式，以保證實驗室所出具的報告具有可信性和高質(zhì)量，最大限度的滿足臨床醫(yī)師診治工作對臨床檢驗的需求。
來源：檢驗醫(yī)學與臨床雜志
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