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近年來，越來越多的研究證據(jù)顯示，微生物群與癌癥密切相關(guān)，甚至在癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2020年5月，以色列魏茨曼科學(xué)研究所 Ravid Straussman 團(tuán)隊在 Science 發(fā)表論文，他們發(fā)現(xiàn)，大部分實體瘤中含有細(xì)菌，這些細(xì)菌大多是存在于癌細(xì)胞內(nèi)的“胞內(nèi)菌”。而且，這些細(xì)菌可能具有腫瘤特異性，不同類型腫瘤中具有不同種類的細(xì)菌。2022年4月，西湖大學(xué)蔡尚團(tuán)隊在 Cell 期刊發(fā)表論文，他們首次證實了乳腺癌組織中存在的多種獨(dú)特 “胞內(nèi)菌”在腫瘤轉(zhuǎn)移定植過程中所起的關(guān)鍵作用，這一發(fā)現(xiàn)也是對傳統(tǒng)腫瘤轉(zhuǎn)移理論的重大突破。2022年9月，以色列魏茨曼科學(xué)研究所 Ravid Straussman 團(tuán)隊和加州大學(xué)圣地亞哥分校 Ravid Straussman團(tuán)隊分別在 Cell 期刊發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)除了細(xì)菌以外，另一類微生物——真菌，也在不同腫瘤中普遍存在，它們與腫瘤轉(zhuǎn)移、癌癥患者生存率降低密切相關(guān)。

2023年9月19日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院王慧、同濟(jì)大學(xué)張鵬以及中科院巴斯德所陳昌斌課題組共同通訊在Cancer Cell（IF=50.3）上發(fā)表了題為“The intratumor mycobiome promotes lung cancer progression via myeloid-derived suppressor cells”的研究性論文。該研究通過真菌富集DNA提取和深度shotgun宏基因組測序，在肺腺癌(LUAD)患者中發(fā)現(xiàn)了聚多曲霉(Aspergillus sydowii)。通過3種不同的同基因肺癌小鼠模型，作者發(fā)現(xiàn)A. sydowii通過IL-1 介導(dǎo)的MDSCs的擴(kuò)增和激活促進(jìn)了肺腫瘤的進(jìn)展，從而抑制了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性和PD-1+CD8+T細(xì)胞的積累。對人體樣本的分析進(jìn)一步證實，豐富的A. sydowii與免疫抑制和患者預(yù)后不良有關(guān)。作者的研究結(jié)果表明，盡管腫瘤內(nèi)真菌群落的生物量很低，但它促進(jìn)了肺癌的進(jìn)展，并且可以針對菌株來改善LUAD患者的預(yù)后。

主要內(nèi)容

一、腫瘤內(nèi)菌群失調(diào)與LUAD病理學(xué)相關(guān)，并富含一種活真菌

近年來已有研究報道了泛癌菌群的存在。通過熒光原位雜交（FISH），研究人員評估了真菌負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)與匹配的非腫瘤組織相比，LUAD腫瘤組織中定植真菌的豐度明顯升高（圖1A）。重要的是，研究人員觀察到LUAD腫瘤組織（24個配對的腫瘤和非腫瘤組織，52個LUAD組織與10個非惡性結(jié)節(jié)組織）中真菌種類豐富，這一點(diǎn)在FungiQuant檢測中得到了進(jìn)一步證實(圖1B, 1C）。根據(jù)Ace和Chao指數(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的α多樣性明顯低于非腫瘤組織（圖1D）。這些數(shù)據(jù)表明，LUAD患者體內(nèi)菌群失調(diào)。

接下來，研究人員探索了真菌群和LUAD病理之間的潛在聯(lián)系。雖然擔(dān)子菌門/子囊菌門在非腫瘤組織與鱗狀和腺狀占主導(dǎo)地位的腫瘤組織中的比率相似，但他們發(fā)現(xiàn)，在侵襲性更強(qiáng)的實體、微乳頭和乳頭占主導(dǎo)地位的亞型中，差異更大，這表明真菌菌群失調(diào)與LUAD侵襲性之間存在潛在的相關(guān)性(圖1E)。此外，研究發(fā)現(xiàn)曲霉位于腫瘤組織與非腫瘤組織的兩個反相關(guān)簇的中心(圖1F)，表明了腫瘤組織中曲霉相關(guān)分類簇的獨(dú)特特征。序列分析也發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中意外富集了聚多曲霉(A. sydowii)(圖1G)。

進(jìn)行培養(yǎng)組學(xué)和PacBio全基因組測序，以驗證真菌DNA序列是否為活菌。從7名另外選擇的LUAD患者的新鮮腫瘤組織中分離出3株活真菌(表S3)，并確認(rèn)為A.sydowii(圖1H和S3A；表S4)。分析了宏基因組功能的改變，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)真菌組中溶酶體、核糖體和RNA降解途徑等幾種信號通路顯著增加(圖1I和S4B;表S6)。綜上所述，結(jié)果有力地揭示了LUAD患者真菌生物群景觀和功能特征的改變，并確定了富集的腫瘤定植活A(yù). sydowii的存在。

圖1.腫瘤內(nèi)菌群失調(diào)與LUAD病理相關(guān)，并鑒定出高度豐富的活菌

二、定植在腫瘤中的A. sydowii通過誘導(dǎo)具有免疫抑制作用的TME來促進(jìn)肺腫瘤的進(jìn)展

為了確定A. sydowii（AS12183）是否對肺部腫瘤的進(jìn)展具有功能性影響，使用已建立的路易斯肺癌（LLC）小鼠模型，在瘤內(nèi)注射A. sydowii AS12183（圖S5A）。研究人員發(fā)現(xiàn)，與煙曲霉菌和白色念珠菌相比，多聚曲霉加速了LUAD的進(jìn)展，表現(xiàn)為腫瘤體積和腫瘤重量的增加(圖2A–2C and S5B)。通過FISH驗證了瘤內(nèi)A. sydowii 的持續(xù)存在（圖S5C）。同樣，用A. sydowii處理后，LLC細(xì)胞增殖明顯增加（圖2D）。這些數(shù)據(jù)表明，A. sydowii 在肺癌進(jìn)展過程中具有功能性作用。

研究表明，微生物群通過與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用影響致癌作用。為了檢測真菌A. sydowii對TME的潛在影響，使用小鼠LLC模型的腫瘤樣本對A. sydowii特異性轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了體內(nèi)RNA-seq分析（圖2E）。上調(diào)基因在髓系白細(xì)胞趨化和遷移、ROS代謝過程和IL-1β生成方面有明顯的富集（p < 0.05）（圖2F）。值得注意的是，與MDSCs和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的調(diào)控基因的表達(dá)在A.sydowii組顯著增加，這與免疫系統(tǒng)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)增強(qiáng)一致。這些數(shù)據(jù)表明，A.sydowii可以通過誘導(dǎo)免疫抑制基因信號來促進(jìn)肺腫瘤的進(jìn)展。

研究人員進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)來確定有或沒有Sydowii感染的浸潤性腫瘤中各種免疫細(xì)胞類型的相對變化。同樣，A. sydowii處理導(dǎo)致MDSCs (CD11b+Gr1+)的比例急劇增加，特別是PMN-MDSCs (CD11b+Ly6G+Ly6Clow)在腫瘤組織中的富集。然而，研究人員沒有觀察到M2巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞群的可量化差異(圖2G, 2H和S5D-S5F)。有趣的是，研究人員還注意到暴露于A. sydowii的小鼠TME中Tregs的比例更高(圖2I和2J)。在感染A. sydowii并使用兩性霉素B (AmB)治療的小鼠中，進(jìn)一步評估了A . sydowii對肺腫瘤進(jìn)展的可能貢獻(xiàn)。顯然，AmB的真菌耗竭阻斷了腫瘤的進(jìn)展(圖2K)。因此，研究人員的數(shù)據(jù)表明，A. sydowii通過MDSCs和Tregs的局部擴(kuò)張促進(jìn)肺腫瘤進(jìn)展，這兩種細(xì)胞都是免疫抑制TME的關(guān)鍵成分。

圖2.腫瘤定植A. sydowii通過誘導(dǎo)免疫抑制TME促進(jìn)肺腫瘤進(jìn)展

三、A.sydowii在肺部的局部定植促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

為了進(jìn)一步證實前面的發(fā)現(xiàn)，研究人員建立了原位LUAD小鼠模型，該模型更接近LUAD的微環(huán)境。通過氣管內(nèi)接種從自發(fā)性KP-LUAD小鼠體內(nèi)獲得并體外擴(kuò)增的KrasLSL-G12D/+/P53fl/fl(KP)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A.sydowii持續(xù)且顯著地促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展(圖3A)。IL-1β，是一種與MDSCs的趨化和擴(kuò)張有關(guān)的腫瘤相關(guān)因子，在腫瘤中上調(diào)（圖3B）。在TME中，MDSCs和Tregs的擴(kuò)增顯著增加，特別是PMN-MDSCs的富集，而不是Th17的富集(圖3C-3E和S5H)。研究表明，MDSCs最初在骨髓中產(chǎn)生，并遷移到腫瘤中，促進(jìn)TME的形成。CD8+程序性細(xì)胞死亡蛋白1 (PD-1)+T細(xì)胞也在原位LUAD小鼠模型中積累(圖3F)。PD-1在腫瘤浸潤性抗原特異性T細(xì)胞上的表達(dá)限制了其抗腫瘤活性。

為了確定真菌生態(tài)失調(diào)對肺腫瘤進(jìn)展的影響，研究人員在原位LUAD小鼠模型中通過口服AmB清除真菌組。正如預(yù)測的那樣，菌群耗竭使暴露于A. sydowii的小鼠免于腫瘤的加速生長(圖3G)�？紤]到所采用的給藥途徑(口服)可能導(dǎo)致小鼠腸道和肺內(nèi)真菌種群的系統(tǒng)清除，研究人員還開發(fā)了一種更有針對性的方法，即霧化吸入Amb。研究人員同樣發(fā)現(xiàn)，AMB治療有效地降低了腫瘤負(fù)擔(dān)(圖3H)。最后，在腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre重組酶誘導(dǎo)的自發(fā)性KP LUAD小鼠模型中，研究了A.sydowii在LUAD進(jìn)展中的確切作用，以探索A.sydowii在LUAD定植中的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)A. sydowii顯著促進(jìn)肺腫瘤進(jìn)展，加速腫瘤細(xì)胞增殖(圖3I和3J)。與之前的觀察結(jié)果一致的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中IL-1β的表達(dá)上調(diào)，并且在A. sydowii處理后，TME中MDSCs、Treg和PD-1+CD8+的比例增加（圖3K-3O、S5N和S5O）。這些結(jié)果表明，瘤內(nèi)A. sydowii通過大量招募和擴(kuò)增MDSCs以及Tregs和PD-1+CD8+T細(xì)胞的浸潤，誘導(dǎo)免疫抑制性局部微環(huán)境，從而導(dǎo)致LUAD進(jìn)展加速。

圖3.A. sydowii在肺部的局部定植促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

四、A.sydowi誘導(dǎo)的免疫抑制是由TME中MDSCs活性增強(qiáng)介導(dǎo)的

研究人員評估了A.sydowii誘導(dǎo)的MDSCs的耐受活性。A.Sydowii處理顯著增加了Arg1和NOS2的表達(dá)。在原位和自發(fā)的小鼠LUAD模型中，A.sydowii提高了從小鼠LUAD組織分離的MDSCs的精氨酸酶活性和NO和ROS的產(chǎn)生(圖4A-4E和S6A-S6C)。在功能上，與未接觸A. sydowii的小鼠相比，暴露A. sydowii小鼠中分離的腫瘤來源的MDSCs存在時，體外T細(xì)胞誘導(dǎo)的LUAD細(xì)胞殺傷功能明顯受損(圖4F和S6D)，這表明A. sydowii促進(jìn)了MDSCs的功能成熟和活性。

據(jù)報道，MDSCs可以誘導(dǎo)Treg的擴(kuò)增，研究人員將原代CD4+T細(xì)胞與從A.sydowii處理的腫瘤組織中分離的MDSCs孵育。發(fā)現(xiàn)與載體MDSCs相比，分化的Treg細(xì)胞比例更高(圖4G、S6E和S6G)。此外，研究人員推測TME中PD-1+CD8+T細(xì)胞的浸潤可能是由于A.sydowii誘導(dǎo)的MDSCs表達(dá)PD-L1所致。事實上，研究人員發(fā)現(xiàn)原代CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)在與來自A.sydowii暴露的小鼠的腫瘤駐留MDSCs孵育后顯著增加(圖4H、S6F和S6H)。

為了進(jìn)一步證實MDSCs在LUAD TME中的作用，研究人員使用Gr1單抗進(jìn)行了體內(nèi)MDSCs耗竭實驗(圖4I)。通過抗Grl處理的MDSC的耗竭顯著降低了聚多曲霉處理的原位LUAD鼠模型中的腫瘤生長（圖4J），并顯著降低了MDSC的豐度，但對PMN-MDSC與M-MDSC的比率沒有影響（圖4K、4L、S6 I和S6 J）。與同型對照相比，Tregs和PD-1+CD 8 +T細(xì)胞的數(shù)量也減少（圖4 M、4 N、S6 K和S6 L）總之，這些結(jié)果最終證明，A. sydowi 誘導(dǎo)的免疫抑制對腫瘤的促進(jìn)作用是通過增加TME中MDSCs的活性來介導(dǎo)的。

圖4.A. sydowii誘導(dǎo)的免疫抑制是由TME中MDSC活性增加介導(dǎo)的

五、A.sydowii通過β-葡聚糖介導(dǎo)的Dectin-1/CARD9信號通路促進(jìn)MDSC的成熟和活性

先天性免疫反應(yīng)是抵御病原體入侵的第一道防線。鑒于巨噬細(xì)胞在真菌病原體的保護(hù)性免疫中的作用，研究人員發(fā)現(xiàn)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的豐度從15%增至近25%（圖5A）。真菌病原體可以通過模式識別β-葡聚糖受體Dectin-1及其下游接頭蛋白CARD9誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞MDSCs。研究人員發(fā)現(xiàn)，骨髓衍生巨噬細(xì)胞（BMDMs）和A. sydowii的共培養(yǎng)上清液促進(jìn)了它們向MDSCs的分化，并增強(qiáng)了CARD9的表達(dá)，這與研究人員的體內(nèi)研究結(jié)果一致（圖S7A-S7C、5B和5C）。

研究人員進(jìn)一步確定了Card9的缺失是否會影響A. sydowi通過MDSCs介導(dǎo)的LUAD加速。值得注意的是，與WT小鼠相比，Card9-/-小鼠在LUAD模型中由A. sydowii誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展加速明顯減弱（圖5D）。與WT相比，Card9-/-小鼠源性腫瘤顯示MDSCs分化減少(圖5E)。與此一致的是，研究人員觀察到TME中浸潤的Tregs和PD-1+CD8+T細(xì)胞比例較小(圖5F和5G)。至于MDSCs的功能，Card9-/-小鼠的ROS、精氨酸酶和NO的產(chǎn)生顯著降低(圖5H-5J)。這些活性較低的MDSCs允許更多的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展減慢(圖5K)�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明，A. sydowii通過β-葡聚糖介導(dǎo)的Dectin-1/CARD9信號通路誘導(dǎo)MDSCs分化和活性。

圖5.A. sydowii通過β-葡聚糖介導(dǎo)的Dectin-1/CARD9信號通路促進(jìn)MDSC的成熟和活性

六、IL-1β阻斷逆轉(zhuǎn)A.sydowii誘導(dǎo)的免疫抑制

暴露于A. sydowii 或β-葡聚糖的WT BMDM 顯示IL-1β的分泌顯著增加，而且，在源自Card9-/-小鼠的腫瘤中觀察到IL-1β分泌減少（圖5L）。因此，研究人員推測，IL1b代表了β-葡聚糖介導(dǎo)的Dectin-1/CARD9信號通路的下游效應(yīng)物。

研究人員用Ultra-LEAF純化的抗IL-1βmAb中和了BMDMs和A. sydowii或β-葡聚糖共培養(yǎng)物中分泌的IL-1β。為了進(jìn)一步驗證IL-1β在LUAD TME 中的作用，研究人員使用IL-1βmAb 進(jìn)行了體內(nèi)IL-1β中和實驗（圖6A）。IL-1βmAb治療顯著降低了A. sydowii處理的原位LUAD小鼠模型的腫瘤生長(圖6B)，并顯著降低了MDSCs的豐度和PMN-MDSC與M-MDSC的比例(圖6C和6D)。與同型對照相比，Tregs和PD-1+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量也減少了(圖6E和6F)。同樣，研究人員觀察到A. sydowii和IL-1βmAb處理小鼠的MDSCs中ROS、精氨酸酶和NO的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致其腫瘤殺傷活性消失(圖6G-6J)。

圖6.阻斷IL-1β可逆轉(zhuǎn)A.sydowii誘導(dǎo)的免疫抑制

七、患者樣本中高豐度的A. sydowii與免疫抑制和不良臨床結(jié)果相關(guān)

為了評估LUAD患者腫瘤內(nèi)A . sydowii與腫瘤免疫抑制環(huán)境之間的關(guān)系，研究人員對92例LUAD患者的腫瘤組織進(jìn)行了FISH和免疫熒光染色，以探索MDSCs、Tregs和PD-1+CD8+T細(xì)胞在TME中的分布(圖7A-7D;表S7)。研究人員發(fā)現(xiàn)A. sydowii的高豐度與腫瘤浸潤的MDSCs、Tregs和PD-1+CD8+T細(xì)胞的增加呈正相關(guān)(圖7E-7G)。這些在LUAD患者中的結(jié)果與研究人員在小鼠LUAD模型中的發(fā)現(xiàn)一致。

為了更深入地了解A . sydowii與患者預(yù)后的關(guān)系，研究人員進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)A. sydowii的富集與患者的侵襲性病理和淋巴結(jié)侵襲有關(guān)(圖7H)�？紤]到在不同階段（80% at IA to 30% at IIIA）的生存的顯著差異，研究人員分析了A. sydowii在I、II、III和IV階段的豐度。有趣的是，研究人員觀察到A. sydowii的豐度隨著階段的增加而增加，這與提出的機(jī)制一致(圖7I)。在分析A. sydowii的預(yù)后價值時，對患者的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)進(jìn)行了分層(圖7J和7K)。總之，研究人員的數(shù)據(jù)不僅有助于支持真菌組在癌癥進(jìn)展中的作用，而且還表明A . sydowii作為預(yù)測疾病結(jié)局的有前途的生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。

圖7.A.sydowii的高豐度與免疫抑制和患者預(yù)后不良有關(guān)

本研究的亮點(diǎn)為

1、在肺腺癌（LUAD）患者中發(fā)現(xiàn)了豐富的腫瘤內(nèi)聚多曲霉（A. sydowii）

2、A. sydowii在三種同基因小鼠肺癌模型中促進(jìn)LUAD

3、A. sydowii通過β-葡聚糖/ Dectin-1/CARD9途徑分泌IL-1b誘導(dǎo)MDSCs

4、大量的A. sydowii與免疫抑制和患者預(yù)后不良有關(guān)