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中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專業(yè)委員會(huì), 中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤基因診斷專業(yè)委員會(huì), 中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)超微與分子病理學(xué)專業(yè)委員會(huì), 等. 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的腫瘤分子病理檢測(cè)臨床實(shí)踐中國專家共識(shí)(2023版)[J]. 中華腫瘤雜志, 2023, 45(9):763-772.
DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20221231-00868.
摘 要
基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)的腫瘤分子病理檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、報(bào)告周期短、靈敏度高、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。然而，在臨床實(shí)踐中，qPCR技術(shù)的性能驗(yàn)證、質(zhì)量管理、異常結(jié)果處理等問題相對(duì)復(fù)雜，缺乏統(tǒng)一規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。因此，專家共識(shí)旨在從qPCR檢測(cè)全流程角度，對(duì)影響檢測(cè)結(jié)果的重要環(huán)節(jié)、檢測(cè)過程中遇到的常見問題及異常結(jié)果判定及處理等提供規(guī)范化意見，達(dá)成基于qPCR技術(shù)的腫瘤分子病理檢測(cè)臨床實(shí)踐中國專家共識(shí)，以規(guī)范檢測(cè)流程并提高結(jié)果準(zhǔn)確性，促進(jìn)技術(shù)發(fā)展和更為廣泛的臨床應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】腫瘤; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 分子檢測(cè); 分子病理; 專家共識(shí)
惡性腫瘤分子病理檢測(cè)是個(gè)體化治療的前提和基礎(chǔ)。目前，我國常用的分子病理檢測(cè)平臺(tái)包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real－time PCR, qPCR)、熒光原位雜交、Sanger測(cè)序和高通量測(cè)序等，其中qPCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。qPCR技術(shù)利用不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)標(biāo)記探針，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度，形成PCR擴(kuò)增曲線，間接反映靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物含量，從而對(duì)靶基因變異情況進(jìn)行定性或半定量分析。目前，常見的qPCR技術(shù)包括擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR、逆轉(zhuǎn)錄qPCR、多重連接依賴性探針擴(kuò)增PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)等，能夠?qū)螯c(diǎn)突變、插入缺失、融合等進(jìn)行檢測(cè)。
qPCR技術(shù)近年來在腫瘤分子病理檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化對(duì)提升腫瘤分子病理檢測(cè)水平和促進(jìn)個(gè)體化診治具有重要意義。本共識(shí)由具有豐富理論和檢測(cè)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的病理、分子病理專家共同發(fā)起并制定，旨在為qPCR技術(shù)檢測(cè)實(shí)踐提供指導(dǎo)和幫助。本共識(shí)包括qPCR檢測(cè)技術(shù)的樣本選擇、前處理、檢測(cè)流程、性能驗(yàn)證、質(zhì)量管理、常見問題和異常結(jié)果處理等多個(gè)臨床實(shí)踐重要部分，推薦意見基于國內(nèi)外臨床實(shí)踐數(shù)據(jù)并結(jié)合我國國情，分為強(qiáng)烈推薦(證據(jù)充分且專家組達(dá)成一致共識(shí)，在檢測(cè)條件充分的環(huán)境下優(yōu)先推薦開展的措施)、推薦(證據(jù)較充分且專家組達(dá)成基本一致共識(shí)，基于特定實(shí)際檢測(cè)條件推薦開展的措施)和不推薦3個(gè)等級(jí)。
一
樣本選擇與前處理
目前腫瘤分子病理檢測(cè)常用樣本主要包括福爾馬林固定石蠟包埋組織(formalin－fixed paraffin－embedding, FFPE)樣本(包括手術(shù)切除和活檢組織樣本)、細(xì)胞學(xué)樣本和體液樣本(包括外周血、腦脊液、漿膜腔積液上清液、唾液和尿液等)，應(yīng)依據(jù)臨床需求、樣本可及性及qPCR檢測(cè)平臺(tái)性能選擇合適的樣本。
(一)樣本選擇
強(qiáng)烈推薦使用手術(shù)切除組織或活檢組織FFPE樣本。組織樣本不可及時(shí)，推薦采用細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行檢測(cè)。若組織和細(xì)胞學(xué)樣本均不可及，推薦外周血等體液樣本進(jìn)行循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)突變檢測(cè)。
(二)樣本前處理
不同類型樣本的前處理應(yīng)根據(jù)各自特點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operating procedure, SOP)，詳盡規(guī)范樣本采集、運(yùn)輸、接收/拒收、保存和前處理流程，確保樣本符合后續(xù)檢測(cè)要求。
1．組織學(xué)樣本：
標(biāo)本離體后應(yīng)在30 min內(nèi)浸泡于10~15倍體積的4%中性甲醛(10%福爾馬林)固定液中，大樣本應(yīng)注意逐層切開以充分固定，根據(jù)樣本大小和組織類型適當(dāng)調(diào)整固定時(shí)間，一般不超過72 h。樣本浸蠟和包埋溫度一般在58~60 ℃，不宜過高。
2．細(xì)胞學(xué)樣本：
包括胸/腹腔積液、心包積液和細(xì)針穿刺標(biāo)本等，強(qiáng)烈推薦將細(xì)胞學(xué)樣本制備成細(xì)胞蠟塊，使用4%中性甲醛(10%中性福爾馬林)固定液或者95%乙醇固定，后續(xù)操作可參照組織樣本處理要求及病理質(zhì)控。也可將細(xì)胞學(xué)樣本涂片或液基細(xì)胞學(xué)制片，鏡下評(píng)估腫瘤細(xì)胞數(shù)量及比例，對(duì)于質(zhì)控合格的細(xì)胞學(xué)樣本，收集細(xì)胞沉渣，直接裂解提取核酸。此外，漿膜腔積液離心后的上清液可作為一種補(bǔ)充檢測(cè)樣本，用于分子病理檢測(cè)，但應(yīng)關(guān)注其假陰性風(fēng)險(xiǎn)，必要時(shí)可與細(xì)胞沉渣的檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證。
3．體液樣本：
外周血是分子檢測(cè)最常用的體液樣本，主要通過分離血漿中ctDNA進(jìn)行分子檢測(cè)。可使用含有游離DNA保護(hù)劑和防細(xì)胞裂解劑的專用采血管，采集不少于10 ml的全血。前處理時(shí)，采用先低速后高速的二次離心法分離血漿。其他體液樣本可參考外周血樣本采集、保存和前處理方法。強(qiáng)烈推薦將體液樣本與組織樣本的前處理和核酸提取等操作分別在相對(duì)獨(dú)立的物理空間(獨(dú)立生物安全柜或?qū)嶒?yàn)室房間)進(jìn)行。
(三)樣本質(zhì)量評(píng)估
在核酸提取前，應(yīng)對(duì)組織和細(xì)胞樣本的前處理過程、保存情況及細(xì)胞成分進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于體液樣本，應(yīng)對(duì)患者治療情況及疾病狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。
1．組織或細(xì)胞學(xué)樣本：
推薦使用2年以內(nèi)的FFPE樣本，病理醫(yī)師須對(duì)腫瘤細(xì)胞含量進(jìn)行評(píng)估，推薦采用腫瘤細(xì)胞不少于200個(gè)，且占比不少于20%的蠟塊，避免使用強(qiáng)酸脫鈣處理后的樣本，避免選取存在組織自溶、退變、大片出血、明顯壞死或結(jié)構(gòu)不清等情況的蠟塊。在應(yīng)用qPCR檢測(cè)結(jié)果輔助診斷時(shí)(如IDH1/2基因突變用于低級(jí)別膠質(zhì)瘤與膠質(zhì)細(xì)胞增生的鑒別診斷、BRAF基因突變用于甲狀腺乳頭狀癌的鑒別診斷等)可備注可疑腫瘤細(xì)胞含量。腫瘤細(xì)胞含量低于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)與臨床醫(yī)師和患者及時(shí)溝通，評(píng)估是否有條件重新采集樣本；如果無法重新采集，可在獲得患者知情同意后再繼續(xù)檢測(cè)，盡量富集腫瘤細(xì)胞，并在報(bào)告中注明質(zhì)控情況及出現(xiàn)假陰性結(jié)果等潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前獲批的qPCR檢測(cè)試劑盒的質(zhì)控指標(biāo)多是建立在檢測(cè)大樣本的場(chǎng)景之下，小樣本(如粗針穿刺和活檢夾取樣本等)和細(xì)胞學(xué)樣本的腫瘤細(xì)胞含量常低于試劑盒給出的有效檢測(cè)范圍，實(shí)驗(yàn)室可自行建立質(zhì)控評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和檢出限。
2．體液樣本：
推薦治療間期采集，如在化療、放療或手術(shù)治療1~2周后采集。盡量避免在患者伴隨其他疾病如嚴(yán)重感染或外傷時(shí)采集，以避免因正常細(xì)胞釋放DNA對(duì)ctDNA稀釋，造成假陰性結(jié)果。外周血應(yīng)避免使用發(fā)生嚴(yán)重溶血或血脂過高等異常樣本。
(四)樣本獲取、富集、運(yùn)輸與保存
FFPE樣本切片前應(yīng)保證切片機(jī)擦拭潔凈無污染物，切片時(shí)每個(gè)樣本使用單獨(dú)的一次性刀片、一次性鑷子和棉簽等耗材，防止不同樣本間交叉污染。對(duì)于腫瘤細(xì)胞占比<20%的樣本，推薦對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集。石蠟切片和蠟卷可室溫運(yùn)輸或短暫保存，推薦保存時(shí)間不超過2周。體液樣本(胸腹水、心包積液和腦脊液等)需要盡快處理，若不能及時(shí)處理建議2~8 ℃下保存不超過24 h。外周血樣本若選用專用采血管可常溫運(yùn)輸保存，時(shí)間不超過7 d，若選用EDTA抗凝管采血，推薦采血后2 h內(nèi)完成血漿分離。分離后的血漿，可暫存于－20 ℃(不超過1周)或－80 ℃(可保存1個(gè)月以上),建議1周內(nèi)完成后繼檢測(cè)。推薦剩余生物樣本和核酸等進(jìn)行分類保存，以備后續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)問題時(shí)追溯原因。
二
檢測(cè)流程與結(jié)果分析
1．核酸提�。�
目前，臨床常用的核酸提取方法有吸附柱法和磁珠法，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自身實(shí)際條件，選擇合適的提取方法和試劑盒，推薦采用經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)注冊(cè)/備案的商品化試劑盒，若采用實(shí)驗(yàn)室自建試劑或其他核酸提取試劑，應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，以確保能夠達(dá)到臨床應(yīng)用要求。
2．核酸質(zhì)量評(píng)估：
核酸質(zhì)量是qPCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提，因此在進(jìn)行qPCR檢測(cè)前，需充分評(píng)估核酸總量、濃度和純度等指標(biāo)。推薦使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，合格的DNA吸光度(A)值260/280比值在1.8左右(一般在1.7~2.0之間)，合格的RNA A260/280比值在2.0左右(一般在1.8~2.1之間)。核酸總量和濃度應(yīng)符合后續(xù)qPCR檢測(cè)要求。不符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的核酸樣本應(yīng)重新進(jìn)行核酸提取。若樣本不足且無法重新采集時(shí)，可嘗試進(jìn)行qPCR檢測(cè)，并在報(bào)告中注明核酸質(zhì)控情況及對(duì)結(jié)果的潛在影響及風(fēng)險(xiǎn)。
3．qPCR檢測(cè)與結(jié)果分析：
強(qiáng)烈推薦采用經(jīng)NMPA注冊(cè)/備案的商品化試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，并根據(jù)試劑盒說明書和實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況建立qPCR檢測(cè)SOP。配制PCR反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)根據(jù)試劑盒要求將樣本核酸稀釋到規(guī)定濃度范圍。核酸質(zhì)量差的組織/細(xì)胞學(xué)樣本可適當(dāng)提高核酸加樣濃度。ctDNA不推薦稀釋后加樣，推薦用提取后原液進(jìn)行核酸加樣。(2)加樣前，檢測(cè)試劑應(yīng)完全融化并充分震蕩混勻，瞬時(shí)離心后備用。融化試劑可2~8 ℃暫存(建議不超過24 h)，避免反復(fù)凍融。(3)加樣時(shí)，避免移液器反復(fù)用力吹打，以減少氣泡和核酸機(jī)械損傷。(4)加樣完成后，將PCR管瞬時(shí)離心，分散對(duì)稱放置于PCR儀內(nèi)，避免儀器熱蓋加壓時(shí)受力不平衡，按照SOP設(shè)置擴(kuò)增程序。
qPCR擴(kuò)增完成后，先確認(rèn)陰性質(zhì)控和陽性/弱陽性質(zhì)控是否在控，再分析樣本檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于處于臨界值或灰區(qū)的樣本，記錄并分析可能原因，必要時(shí)需進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)。
4．檢測(cè)報(bào)告出具：
各醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，設(shè)置符合規(guī)范的結(jié)果報(bào)告模版，由病理醫(yī)師和分子檢測(cè)人員協(xié)同及時(shí)、準(zhǔn)確地完成分子病理診斷報(bào)告，為患者診療提供參考。共識(shí)推薦qPCR基因檢測(cè)報(bào)告至少包括以下幾方面內(nèi)容：(1)患者信息及樣本信息，包括患者姓名、性別、年齡、門診號(hào)或住院號(hào)、樣本來源、樣本編號(hào)或病理編號(hào)、臨床診斷、病理診斷、樣本類型、樣本接收時(shí)間、樣本病理質(zhì)控和核酸質(zhì)控信息等。(2)檢測(cè)項(xiàng)目及方法，包括檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)方法和儀器、所用試劑及其性能(如敏感度、特異度、局限性以及檢測(cè)范圍和位點(diǎn)等)。(3)檢測(cè)結(jié)果，包括檢測(cè)基因變異位點(diǎn)與檢測(cè)結(jié)果。基因變異位點(diǎn)命名推薦使用人類基因組變異協(xié)會(huì)命名方法。檢測(cè)結(jié)果推薦以"檢出"或"未檢出"來表述檢測(cè)基因是否"存在"或"不存在"位點(diǎn)變異。如有其他意見或建議可以在結(jié)果中注明。(4)局限性說明，檢測(cè)結(jié)果后建議增加備注內(nèi)容，以說明檢測(cè)的責(zé)任范圍及局限性。(5)報(bào)告審核和簽發(fā)，qPCR檢測(cè)報(bào)告須經(jīng)具有分子病理診斷資格的授權(quán)簽字人簽名后，方可發(fā)出。
三
質(zhì)量控制
為保證實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范運(yùn)行以及qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)建立完善的質(zhì)量管理體系。對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員、儀器設(shè)備、試劑耗材、樣本、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及檢測(cè)能力等進(jìn)行全面規(guī)范、驗(yàn)證和評(píng)估，建立相應(yīng)管理制度、SOP及各種相關(guān)記錄。規(guī)范質(zhì)量控制活動(dòng)，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)和室間比對(duì)等，并對(duì)質(zhì)量進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)。
(一)試劑性能驗(yàn)證
在正式開展qPCR技術(shù)相關(guān)的臨床檢測(cè)之前，應(yīng)完成性能驗(yàn)證或性能確認(rèn)。使用NMPA注冊(cè)/備案的qPCR檢測(cè)試劑盒和相關(guān)耗材，在開展臨床檢測(cè)前需要進(jìn)行性能驗(yàn)證，即實(shí)驗(yàn)室按照說明書操作，能復(fù)現(xiàn)生產(chǎn)廠家所宣稱的檢測(cè)性能。這里需要注意的是，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室利用試劑盒開展其預(yù)期用途以外的檢測(cè)(如應(yīng)用于非試劑盒規(guī)定的樣本類型)或者更換系統(tǒng)內(nèi)儀器或其重要部件以及改變?cè)噭┙M分以及操作流程變化時(shí)，應(yīng)參照實(shí)驗(yàn)室自建檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行性能確認(rèn)和日常管理。
進(jìn)行性能驗(yàn)證時(shí)，推薦根據(jù)試劑盒說明書和檢測(cè)項(xiàng)目實(shí)際情況，適當(dāng)簡(jiǎn)化方案，側(cè)重驗(yàn)證對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響的性能指標(biāo)，主要包括但不限于準(zhǔn)確度、檢出限、精密度、交叉反應(yīng)和抗干擾能力等。
1．準(zhǔn)確度：
一般采用標(biāo)準(zhǔn)品和已知結(jié)果的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，通過陽性符合率和陰性符合率進(jìn)行評(píng)價(jià)。選取樣本時(shí)，推薦包含陰性樣本、陽性樣本和弱陽性樣本。陽性樣本盡量覆蓋試劑的預(yù)期測(cè)定范圍，例如腫瘤突變檢測(cè)盡量涵蓋常見突變位點(diǎn)，并在后續(xù)日常檢測(cè)中對(duì)預(yù)期測(cè)定范圍進(jìn)行持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)。
2．檢出限：
使用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液，梯度稀釋至檢出限濃度，重復(fù)測(cè)定多次。評(píng)價(jià)該檢出限濃度樣本是否能穩(wěn)定檢出預(yù)期結(jié)果。
3．精密度：
精密度包括重復(fù)性和重現(xiàn)性兩個(gè)方面。重復(fù)性推薦使用一定數(shù)量的臨床樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，在同樣的條件下短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)。重現(xiàn)性推薦使用一定數(shù)量的臨床樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，在不同批次、不同日期由不同操作人員在多臺(tái)儀器上進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)。
4．交叉反應(yīng)：
對(duì)于基因突變檢測(cè)，可對(duì)該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的不同突變類型進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，并可對(duì)序列相近或具有一定同源性的突變或野生型基因序列進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證�？蛇x取已知突變陽性樣本與其他突變陽性標(biāo)準(zhǔn)品混合，重復(fù)檢測(cè)多次，預(yù)期突變陽性位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為檢出，其余位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為未檢出。
5．抗干擾能力：
實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)試劑說明書和臨床實(shí)際情況，選擇需要驗(yàn)證的干擾物質(zhì)及濃度。對(duì)于外周血和細(xì)胞學(xué)樣本，可評(píng)估抗凝劑和樣本保存液等對(duì)結(jié)果的影響。
(二)室內(nèi)質(zhì)控
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注重常規(guī)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。室內(nèi)質(zhì)控品可以使用商品化質(zhì)控品或?qū)嶒?yàn)室自制質(zhì)控品。推薦使用商品化質(zhì)控品，如為自制質(zhì)控品，應(yīng)有制備和驗(yàn)證的程序及記錄。設(shè)置陽性質(zhì)控、弱/臨界陽性質(zhì)控(一般建議為檢出限的2~4倍濃度)和陰性質(zhì)控，質(zhì)控品與待測(cè)樣本一同進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)。注意質(zhì)控品的分裝，最好當(dāng)次用完，避免反復(fù)凍融。此外，可對(duì)日常檢測(cè)中各突變位點(diǎn)陽性率進(jìn)行回顧和持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常。檢測(cè)結(jié)果失控時(shí)，應(yīng)有失控分析處理程序、糾正和預(yù)防措施及相關(guān)記錄等。
(三)室間質(zhì)評(píng)
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或能力驗(yàn)證，推薦每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目每年應(yīng)參加不少于1次。此外，實(shí)驗(yàn)室還可選擇已獲得臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)、且已開展相同項(xiàng)目的同級(jí)別或更高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室間比對(duì)活動(dòng)。對(duì)于室間質(zhì)評(píng)中發(fā)現(xiàn)的問題，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立分析處理程序，并由實(shí)驗(yàn)人員、質(zhì)控人員和實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人共同采取糾正措施并記錄，消除隱患并防止同類問題再次發(fā)生。
四
常見問題與處理建議
檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到多環(huán)節(jié)、多方面因素的影響，如樣本類型、樣本采集過程、樣本保存運(yùn)輸條件、樣本預(yù)處理、核酸提取過程、qPCR檢測(cè)過程、儀器、試劑、耗材、實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及qPCR技術(shù)的局限性等，可能會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線形態(tài)異常、臨界值、假陽性、假陰性和檢測(cè)失敗等情況。當(dāng)qPCR實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)，強(qiáng)烈推薦根據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄及SOP對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行逐步逐項(xiàng)的問題排查。對(duì)于qPCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)污染會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。因此，應(yīng)采取預(yù)防、監(jiān)控、控制和消除污染的措施，無污染是PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。當(dāng)排除qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)本身的問題后，應(yīng)按照試劑盒說明書上的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。如果根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或其他線索對(duì)結(jié)果產(chǎn)生疑議，必要時(shí)可采用其他廠家試劑盒或其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，或?qū)颖舅椭劣匈Y質(zhì)的其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室或第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)。
分子病理實(shí)驗(yàn)室qPCR檢測(cè)最常見問題主要有樣本質(zhì)量問題(表1)、擴(kuò)增曲線問題(表2)和異常結(jié)果問題，共識(shí)根據(jù)檢測(cè)過程中觀察到的異�，F(xiàn)象，分析原因并針對(duì)性地給出問題解決方案，以及預(yù)防問題再次發(fā)生的措施。
(一)樣本質(zhì)量問題
當(dāng)FFPE樣本經(jīng)病理評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量低于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可能會(huì)引起假陰性結(jié)果，建議與臨床醫(yī)師和患者及時(shí)溝通，重新采集樣本。如果無法重新采集，可在獲得患者知情同意后嘗試進(jìn)行檢測(cè)，并在結(jié)果報(bào)告中注明樣本的質(zhì)控情況和假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。若樣本前處理不當(dāng)或保存年限過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致提取的核酸質(zhì)量不佳，影響qPCR檢測(cè)。核酸提取過程中操作不規(guī)范，如脫蠟不徹底、乙醇揮發(fā)不徹底、脫蠟過程樣本損失和酶消化時(shí)間不足等也會(huì)影響后續(xù)檢測(cè)。
(二)擴(kuò)增曲線Ct值臨界問題
因腫瘤細(xì)胞含量或核酸質(zhì)量過低造成的突變位點(diǎn)Ct值臨界，可在結(jié)果中注明。樣本內(nèi)對(duì)照和突變信號(hào)都出現(xiàn)Ct值臨界且擴(kuò)增曲線形態(tài)不佳或熒光值不高時(shí)，有可能是樣本中存在PCR反應(yīng)抑制物。樣本本身含有的一些物質(zhì)(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程引進(jìn)的有機(jī)溶劑(如二甲苯、無水乙醇等)均有可能成為PCR抑制物�？煽紤]適當(dāng)稀釋核酸降低抑制物濃度后重復(fù)qPCR實(shí)驗(yàn)，或?qū)怂徇M(jìn)行二次純化、重新提取不含抑制物的臨床樣本以及換用專門優(yōu)化的核酸提取純化試劑盒等方案。排除上述因素及污染因素后，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍然存在臨界值的樣本，可換用引物/探針位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同的PCR試劑盒(有可能樣本在引物/探針結(jié)合位點(diǎn)存在突變或單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)合效率不足)或借助其他技術(shù)平臺(tái)(如高通量測(cè)序和熒光原位雜交等)進(jìn)行驗(yàn)證。
(三)擴(kuò)增曲線形態(tài)異常
擴(kuò)增曲線翹尾常見原因是污染和非特異性擴(kuò)增。用于臨床診斷的qPCR試劑、配套儀器和擴(kuò)增程序設(shè)置是經(jīng)過優(yōu)化和驗(yàn)證的，一般會(huì)將非特異性擴(kuò)增問題優(yōu)化的較好，然而個(gè)別位點(diǎn)仍可能存在該現(xiàn)象。在日常工作中，一般經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后，熟悉所用qPCR試劑盒特點(diǎn)，記錄其在哪些位點(diǎn)一般不發(fā)生翹尾，在哪些位點(diǎn)容易發(fā)生翹尾。一般不發(fā)生翹尾的位點(diǎn)發(fā)生翹尾時(shí)，需要考慮污染的可能，同時(shí)可通過內(nèi)對(duì)照Ct值大小判斷是否上樣量過大以及是否存在PCR抑制物等，排除這些因素后若仍存在該現(xiàn)象，可考慮換用不同引物探針設(shè)計(jì)的qPCR試劑盒或其他技術(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證。
擴(kuò)增曲線出現(xiàn)下彎、彎折、不規(guī)則形狀和部分孔位曲線異常等情況時(shí)，可能涉及儀器、耗材、試劑及實(shí)驗(yàn)流程等方面問題�？筛鶕�(jù)該現(xiàn)象是多次實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)、某一次實(shí)驗(yàn)中整體出現(xiàn)或某一次實(shí)驗(yàn)中某孔出現(xiàn)等進(jìn)行原因分析。檢查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，是否存在電壓不穩(wěn)、桌面震動(dòng)或溫濕度變化過大等現(xiàn)象。檢查儀器的電路、光源、光路、升降溫模塊及儀器校準(zhǔn)記錄等。檢查qPCR試劑盒與儀器是否匹配，不同品牌型號(hào)儀器的升降溫速度、熒光采集和校正設(shè)置等各方面技術(shù)參數(shù)不同，須采用針對(duì)不同儀器優(yōu)化的試劑盒。檢查耗材與儀器是否匹配，非儀器配套PCR管可能存在透光性不均勻或與儀器孔板模塊貼合不嚴(yán)加熱不均勻的可能。檢查試劑是否存在運(yùn)輸、存放或使用時(shí)溫度不當(dāng)，檢查試劑有效期，是否反復(fù)凍融多次等，試劑使用時(shí)應(yīng)融化完全并充分混勻。檢查PCR擴(kuò)增程序的參數(shù)設(shè)置是否有誤，如溫度、循環(huán)次數(shù)、基線信號(hào)采集和上機(jī)體積等。注意上機(jī)前PCR反應(yīng)體系一旦配制完成不可過久放置，須盡快上機(jī)，且PCR管內(nèi)不應(yīng)該有液體掛壁或有氣泡，氣泡在擴(kuò)增過程中破裂也可能導(dǎo)致熒光信號(hào)異常。上機(jī)前檢查PCR管蓋是否蓋嚴(yán)，管和管蓋表面是否存在污物影響光信號(hào)采集，管內(nèi)液體量是否正常。檢查PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物管是否存在管蓋崩開或管內(nèi)液體蒸發(fā)減少甚至蒸干的現(xiàn)象。
(四)常見的異常結(jié)果有假陽性、假陰性和臨床反饋異常等情況
1．懷疑假陽性的情形有：
(1)內(nèi)對(duì)照的Ct值明顯小于試劑盒規(guī)定的Ct值范圍，同時(shí)突變曲線Ct值在臨界值附近呈弱陽性或陽性時(shí)，有可能是由于上樣濃度過高引起的假陽性。建議稀釋核酸至適宜濃度范圍內(nèi)后重新檢測(cè)。(2)同一批次鄰近樣本或連續(xù)多個(gè)樣本出現(xiàn)同一位點(diǎn)突變陽性結(jié)果時(shí)，尤其是1例樣本強(qiáng)陽其余樣本弱陽的現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)考慮污染導(dǎo)致的假陽性。建議重新切取組織樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)。注意減少氣溶膠的產(chǎn)生，每步操作只打開1個(gè)管蓋。當(dāng)懷疑氣溶膠污染時(shí)，可使用長(zhǎng)時(shí)間開蓋暴露于實(shí)驗(yàn)環(huán)境空氣中的去離子水作為陰性質(zhì)控，排除污染后重新進(jìn)行檢測(cè)。
2．懷疑假陰性的情形有：
(1)內(nèi)對(duì)照的Ct值大于試劑盒規(guī)定的Ct值范圍，待測(cè)基因突變信號(hào)未升起或晚于陽性閾值升起時(shí)需要考慮假陰性�？赡茉虬ㄉ蠙C(jī)樣本核酸有效濃度較低、含有PCR抑制物、或者漏加、少加樣本等。可提高上機(jī)濃度或重新提取核酸后進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。(2)對(duì)于腫瘤細(xì)胞數(shù)量少或占比低的樣本，即使qPCR實(shí)驗(yàn)質(zhì)控都合格，仍存在假陰性可能，需在檢測(cè)報(bào)告中注明。這種情形在活檢小樣本、細(xì)胞學(xué)樣本和ctDNA樣本更易發(fā)生。
3．臨床反饋異常結(jié)果的情形有：
(1)本次檢測(cè)結(jié)果與其他單位檢測(cè)結(jié)果不一致；(2)檢測(cè)結(jié)果與臨床治療效果或病理診斷不符。應(yīng)充分考慮檢測(cè)方法和試劑的差異及局限性、多次切片后蠟塊中腫瘤細(xì)胞含量有無減少、腫瘤異質(zhì)性及腫瘤進(jìn)展變化等因素，結(jié)合患者家族史、治療史和其他臨床信息，積極與臨床醫(yī)師和患者溝通。
五
qPCR檢測(cè)局限性
雖然qPCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短、敏感度和特異度高等優(yōu)點(diǎn)，但由于該技術(shù)本身局限性，只能檢出試劑盒涵蓋的基因變異位點(diǎn)，未知的突變或在試劑盒檢測(cè)范圍以外的罕見變異無法檢出。如在中國肺腺癌人群中，采用qPCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變時(shí)，約有5%的EGFR罕見突變無法檢出，另外，qPCR技術(shù)無法提供基因變異豐度等信息。因此，采用qPCR方法未檢出基因變異的腫瘤樣本，推薦采用高通量測(cè)序技術(shù)等作為補(bǔ)充，以發(fā)現(xiàn)少見突變類型的潛在治療獲益患者。對(duì)于無明確熱點(diǎn)突變的基因如BRCA1/2，不推薦采用qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
六
總結(jié)
qPCR技術(shù)應(yīng)用于腫瘤分子病理診斷具有高靈敏度和高特異度、操作便捷和閉管檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，適用于對(duì)已知的基因點(diǎn)突變、短插入和缺失突變、已知的基因融合變異進(jìn)行檢測(cè)(強(qiáng)烈推薦)。qPCR技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)未知突變類型或試劑盒檢測(cè)范圍以外的突變位點(diǎn)以及無明確熱點(diǎn)突變的基因時(shí)存在局限性(不推薦)。
根據(jù)不同樣本類型建立合理可行的SOP，詳盡規(guī)范樣本采集、運(yùn)輸、接收/拒收、保存和前處理流程(強(qiáng)烈推薦)。腫瘤基因突變檢測(cè)優(yōu)先推薦使用4%中性甲醛固定石蠟包埋的手術(shù)切除組織或活檢組織(強(qiáng)烈推薦)。FFPE樣本檢測(cè)前須進(jìn)行病理質(zhì)控，對(duì)樣本的前處理、保存情況及細(xì)胞成分進(jìn)行評(píng)估，使用2年以內(nèi)的近期樣本，并優(yōu)先選取富含腫瘤細(xì)胞的蠟塊(強(qiáng)烈推薦)。FFPE樣本經(jīng)病理評(píng)估低于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)與臨床醫(yī)師和患者及時(shí)溝通，評(píng)估是否有條件重新采集樣本；如果無法重新采集，可在獲得患者知情同意后再繼續(xù)檢測(cè)，盡量富集腫瘤細(xì)胞，并在報(bào)告中注明樣本的質(zhì)控情況及出現(xiàn)假陰性結(jié)果等潛在風(fēng)險(xiǎn)(推薦)。對(duì)于無法獲取腫瘤組織樣本的患者，可考慮使用細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行檢測(cè)以及外周血等體液樣本進(jìn)行ctDNA檢測(cè)(推薦)。
在使用任何一種方法進(jìn)行臨床樣本核酸提取前，應(yīng)對(duì)其核酸提取效率和質(zhì)量等進(jìn)行充分評(píng)估，進(jìn)行性能驗(yàn)證(強(qiáng)烈推薦)。采用經(jīng)過NMPA注冊(cè)/備案的試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，并根據(jù)試劑盒說明書和實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，建立檢測(cè)SOP(強(qiáng)烈推薦)。設(shè)置規(guī)范化的結(jié)果報(bào)告模板，并說明檢測(cè)的責(zé)任范圍及局限性(強(qiáng)烈推薦)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立完善的質(zhì)量管理體系，開展新的臨床qPCR檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)，對(duì)質(zhì)量進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)(強(qiáng)烈推薦)。
qPCR實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄及SOP對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行逐步逐項(xiàng)的問題排查(強(qiáng)烈推薦)。采取預(yù)防、監(jiān)控、控制和消除污染的措施，無污染是qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提(強(qiáng)烈推薦)。當(dāng)排除qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)本身的問題后，推薦按照試劑盒說明書上的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀，必要時(shí)可換用其他廠家試劑盒或其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，或?qū)颖舅椭劣匈Y質(zhì)的其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室或第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)(強(qiáng)烈推薦)。使用qPCR方法未檢出任何突變的腫瘤樣本，可以考慮高通量測(cè)序等檢測(cè)方法作為補(bǔ)充，以發(fā)現(xiàn)少見突變類型的潛在治療獲益患者(推薦)。
參考文獻(xiàn)略。
學(xué)術(shù)顧問：
劉東戈(北京醫(yī)院病理科)
石懷銀(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科)
應(yīng)建明(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
專家組成員(按姓氏漢語拼音字母排序)
柏乾明(復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科)
畢闊(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院病理科)
陳皇(中日友好醫(yī)院病理科)
崔文麗(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
董磊(上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院病理科)
董周寰(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科)
郭蕾(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
韓博(山東醫(yī)科大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科)
韓昱晨(上海市胸科醫(yī)院病理科)
何磊(北京醫(yī)院病理科)
何蓮(遼寧省腫瘤醫(yī)院病理科)
胡曉彤(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院病理科)
黃潔(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院)
黃文亭(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院病理科)
吉茹(內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院病理科)
紀(jì)元(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科)
姜國忠(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
蔣興然(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院病理科)
康南(北京大學(xué)人民醫(yī)院病理科)
柯尊富(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科)
李佳(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
李江濤(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
李蘭(北京積水潭醫(yī)院病理科)
李衛(wèi)華(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
李文斌(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
李小燕(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科)
廉沈沂(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科)
劉楠(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科)
劉希(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
劉澤兵(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院病理科)
羅韜(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
梅開勇(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)
孟宏學(xué)(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科)
歐陽能太(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院細(xì)胞分子診斷中心)
師藝(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科)
蘇丹(浙江省腫瘤醫(yī)院病理科)
唐源(四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科)
王芳(中山大學(xué)腫瘤防治中心分子診斷科)
王雷明(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院病理科)
王秋實(shí)(陸軍特色醫(yī)學(xué)中心 大坪醫(yī)院病理科)
魏冰(河南省腫瘤醫(yī)院分子病理科)
吳偉(上海肺科醫(yī)院病理科)
武艷(吉林省腫瘤醫(yī)院病理科)
郗彥鳳(山西省腫瘤醫(yī)院病理科)
徐紫光(河南省人民醫(yī)院病理科)
楊軍(南京鼓樓醫(yī)院病理科)
葉豐(四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床病理研究所分子診斷室)
葉秋容(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院病理科)
于國華(煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院病理科)
岳君秋(湖北省腫瘤醫(yī)院病理科)
張海偉(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科)
張淑君(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科)
張?jiān)葡?濰坊市人民醫(yī)院病理科)
趙有財(cái)(南京市第一醫(yī)院病理科)
鄭晶(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科)
鄭燕影(江蘇省中醫(yī)院病理科)
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郭蕾(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
董周寰(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科)
李衛(wèi)華(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科)
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