亚洲精品久久无码2021,偷拍亚洲另类无码专区制服,亚洲欧美性都花花世界,国产熟女的精品视频大全,色偷偷2025免费视频观看,撅着大腚SXMV色香视频

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程存在廣泛的遺傳變化和相關(guān)基因的功能及活動失調(diào)[1]。在癌癥中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常已有40余年，研究發(fā)現(xiàn)其對基因表達(dá)、基因組穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。

DNA甲基化檢測樣本易于從組織、血液、尿液、胸腹水和痰液中獲得，檢測方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性佳和成本低的特點(diǎn)，作為新型的生物標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的早期診斷，包括肺癌、消化道腫瘤、膠質(zhì)瘤和婦科腫瘤等[2-3]。DNA甲基化結(jié)合其他臨床診斷指標(biāo)，在惡性腫瘤的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用[4]。

限于篇幅，本文主要就DNA甲基化的生物學(xué)特征和作用機(jī)制、檢測方法以及在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行評述，以提高DNA甲基化檢測對婦科腫瘤精準(zhǔn)診斷的水平。

1、DNA甲基化的概念及生物學(xué)功能

甲基化屬于表觀遺傳學(xué)修飾，是在DNA序列不變的情況下，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，維護(hù)染色體的完整性，以調(diào)節(jié)DNA重組和某些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性，與人類發(fā)育和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代，轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶(5mC)[5]，即DNA甲基化。甲基化所引起的原癌基因表達(dá)激活與抑癌以及修復(fù)基因表達(dá)失活導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。腫瘤細(xì)胞甲基化的特點(diǎn)是：癌細(xì)胞的全基因組水平處于低甲基化狀態(tài)(比正常低20%圖片60%)，發(fā)生在癌癥早期，并且與腫瘤的嚴(yán)重程度和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]；抑癌基因、DNA修復(fù)基因啟動子區(qū)域CpG島高度甲基化，特定基因啟動子區(qū)域異常的高甲基化可以導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的改變，從而致使基因沉默，是惡性腫瘤中表觀遺傳學(xué)特征之一。DNA甲基化貫穿整個腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，甲基化相關(guān)酶的突變也可能引起腫瘤的發(fā)生，啟動子區(qū)域甲基化情況的檢測可作為腫瘤前期篩查和預(yù)后的一項(xiàng)臨床指標(biāo)[8]。目前為止，已有明確研究表明DNA甲基化可用于乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的診斷，準(zhǔn)確率高達(dá)95%，在協(xié)助婦科腫瘤的診斷上也顯示了很好的應(yīng)用前景，這些進(jìn)展為腫瘤的早篩和預(yù)防提供了新方法[9]。

2、DNA甲基化檢測的方法

DNA甲基化檢測已是成熟的分子病理學(xué)技術(shù)，分為檢測整體基因組和特定基因位點(diǎn)兩種。前者有變性高效液相色譜法、SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法、基于抗5mC的免疫化學(xué)法等；后者有Southern印跡雜交法、焦磷酸測序法、重亞硫酸氫鈉修飾后測序法、甲基化特異性PCR法和亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法等[10]。根據(jù)樣本DNA預(yù)處理的方法不同，也可將DNA甲基化檢測方式分為3類：親和富集預(yù)處理法、限制性酶切預(yù)處理法與亞硫酸氫鹽處理法[11]。由于前兩種預(yù)處理法的某些不足，通過亞硫酸氫鹽預(yù)處理法進(jìn)行的DNA甲基化檢測與分析是目前的主流方法，常用的有甲基化特異性數(shù)字PCR(methylation specific PCR, MS-PCR)、甲基化熒光法(MethyLight)、核酸質(zhì)譜、甲基化芯片等。基于PCR擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽預(yù)處理法不需要昂貴的設(shè)備，方法簡便易行，有基因擴(kuò)增室的單位都能開展。

3、DNA甲基化檢測在腫瘤診斷中的應(yīng)用

3.1 泛癌種早篩檢測

液體活檢血液標(biāo)本被證明含有腫瘤的遺傳物質(zhì)且可以被檢測，循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的基因組譜已被證明與相應(yīng)腫瘤的基因組譜密切匹配，具有協(xié)助腫瘤的精準(zhǔn)診斷價值。通過液體活檢進(jìn)行多癌種早期篩查和風(fēng)險(xiǎn)評估是DNA甲基化檢測的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一。2016年1月，測序巨頭Illumina公司宣布投資1億美元成立GRAIL公司，目的是希望通過血液檢測來實(shí)現(xiàn)癌癥早期篩查。GRAIL投入重金先后進(jìn)行4項(xiàng)大型臨床研究，重點(diǎn)關(guān)注腫瘤早期篩查，分別為CCGA、STRIVE、SUMMIT、PATHF-IDER。PATHFINDER計(jì)劃(NCT04241796)是2019年12月啟動，此項(xiàng)目為前瞻性干預(yù)臨床試驗(yàn)，招募受試者大約6 200例，均為尚未診斷為腫瘤的50歲以上高危人群，通過比較其多癌種早篩產(chǎn)品Galleri檢測結(jié)果和金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果，來評估Galleri產(chǎn)品在真實(shí)的癌癥早篩場景中的檢測性能。從上述的研究中GRAIL積累了龐大的樣本數(shù)據(jù)庫，建立和持續(xù)優(yōu)化檢測標(biāo)準(zhǔn)和算法。大樣本和長周期的前瞻性研究為其癌癥早篩產(chǎn)品提供了真實(shí)世界的研究評估數(shù)據(jù)。GRAIL公司在2021年美國臨床腫瘤年會(American Society of Clinical Oncology, ASCO)年度大會上公布了其用于多癌種早篩產(chǎn)品Galleri首批臨床數(shù)據(jù)(PATH-FINDER計(jì)劃)。Galleri是一項(xiàng)基于血液cfDNA靶向甲基化檢測的分析方法，可檢測、區(qū)分臨床分期的50多種癌癥類型,檢測多種癌癥的同時可識別其起源的組織。在5 000多例的檢測樣本中，Galleri的總體檢測靈敏度為51.5%。隨著癌癥患者臨床分期的升級Galleri的靈敏度也穩(wěn)步提升，其 Ⅰ 期患者檢測靈敏度為17%，Ⅱ期為40%，Ⅲ期為77%，Ⅳ期為90%，其檢測的特異性最終達(dá)到99.4%。此外，Galleri對于癌癥的組織溯源定位非常的精準(zhǔn)，可達(dá)到88.7%的準(zhǔn)確性[12]。目前，Galleri已被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)為“突破性設(shè)備”。雖然該測試還未獲得FDA全面批準(zhǔn)上市，但多個地區(qū)已準(zhǔn)予該測試在50多家醫(yī)院和1 100 余家診斷機(jī)構(gòu)使用。

3.2 特定癌種檢測

DNA甲基化具有組織的特異性，這是異常甲基化基因檢測能助力腫瘤診斷的基礎(chǔ)，也是精準(zhǔn)診斷的需要。目前已經(jīng)用于臨床的血Spetin9基因甲基化檢測，具有較高的靈敏度和特異度，可輔助結(jié)直腸癌的診斷。乳腺癌患者中RASSF1A、SOX17、p16、CDH1、CyclinD2和RARβ2基因啟動子區(qū)域都存在高甲基化狀態(tài)。p16基因啟動子區(qū)域的甲基化檢測可作為胰腺癌早期篩查的潛在標(biāo)志物[13]。通過特定癌種開發(fā)的cfDNA/ctDNA的異常甲基化檢測有望在腫瘤的精準(zhǔn)診斷和個體化治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

截止2021年12月31日，獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局試劑盒注冊證的基因甲基化產(chǎn)品共有9個，其中包含1個膠質(zhì)瘤的MGMT基因甲基化檢測試劑、1個肺癌SHOX2與RASSF1A基因甲基化檢測試劑、1個胃癌血液RNF180與Septin9基因甲基化檢測試劑、3個結(jié)直腸癌血液Septin9基因甲基化檢測試劑、2個結(jié)直腸癌糞便SDC2基因和1個結(jié)直腸癌糞便FIT-DNA多靶點(diǎn)檢測試劑盒。此外，在肝癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等亦在臨床驗(yàn)證階段，臨床的應(yīng)用指日可待。

3.3 在女性生殖系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用

3.3.1 內(nèi)膜癌甲基化基因檢測

隨著肥胖和壽命的增加，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升。宮腔鏡獲取子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行組織病理檢查是內(nèi)膜癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是這種創(chuàng)傷性檢查除了給受檢者帶來不適外，由于取材的局限性，組織病理學(xué)診斷的結(jié)果常常受到取材的部位、樣本的大小和質(zhì)量的影響，客觀上要求通過相應(yīng)的分子病理學(xué)檢查提高診斷尤其是早期診斷的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)宮頸刷獲得的細(xì)胞樣本中亦可發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，這種微創(chuàng)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可以進(jìn)行DNA甲基化檢測協(xié)助內(nèi)膜癌的診斷[14-15]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)膜癌甲基化基因的特異性達(dá)到了85%以上，包括ADCYAP1、ASCL2、BHLHE22、CDH13、CDO1、CELF4、GALR1、HAND2、HS3ST2、HTR1B、MAGI2、MME、POU4F3、RASSF1和ZNF662，AUC值范圍從0.80到0.96。目前單個DNA甲基化基因檢測的靈敏度還不足以用作篩查試驗(yàn)，高甲基化基因的組合以及DNA甲基化和其他方法的組合能提高檢測的靈敏度和特異度[16-18]，為內(nèi)膜癌檢查提供一種有用的方法。多基因組合包括CDO1/CELF4、BHLHE22/CDO1/CELF4、HLHE22/CDO1/HAND2、BHLHE22/CDO1/TBX5、CADM1/MAL/miR124-2、HOXA9/RASSF1/HTR1B、甲基化(BHLHE22、CDO1、TBX5和HAND2)與PTEN和TP53的突變相結(jié)合，其靈敏度為60.0% 圖片91.8%，特異度為70% 圖片100%。對于微創(chuàng)標(biāo)本甲基化標(biāo)記物檢測內(nèi)膜癌的作用目前尚有不一致的研究結(jié)果，由北京協(xié)和醫(yī)院牽頭的全國16家醫(yī)院開展“基于宮頸細(xì)胞學(xué)CDO1/CELF4甲基化的內(nèi)膜癌早篩早診多中心對列萬人研究(EndoMethy)”將成為全球最大人群內(nèi)膜癌甲基化臨床研究，其結(jié)果有望為內(nèi)膜癌早篩提供臨床價值的真實(shí)世界。

3.3.2 卵巢癌甲基化基因檢測

盡管卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，居?jì)D科惡性腫瘤第3位，但死亡率卻高于宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌。究其原因，卵巢癌起病隱匿，臨床癥狀缺乏特異性，難以早期發(fā)現(xiàn)；此外缺乏有用的腫瘤標(biāo)志物，臨床使用的檢查和診斷方法有限，靈敏度和特異度不高，導(dǎo)致大多數(shù)卵巢癌患者確診時已經(jīng)處于中晚期，且療效不佳[19]。卵巢癌起源于卵巢表面的生發(fā)上皮具有分化的潛能，因此卵巢癌具有分子異質(zhì)性，從而導(dǎo)致其診斷的復(fù)雜性[20-23]。DNA甲基化檢測輔助卵巢癌的早期診斷顯示了較好的應(yīng)用前景，一項(xiàng)宮頸刮片研究發(fā)現(xiàn)，AMPD3、NRN1和TBX15甲基化組合的靈敏度為61%圖片76%，特異度70%圖片88%。HOXD9、FOXA1、RASSF1A、ADAMTS1和BNC1、CDO1、APC甲基化，其靈敏度與特異度皆提示其可發(fā)展成為新的微創(chuàng)卵巢癌篩查標(biāo)志物[24-27]。有學(xué)者主要用晚期卵巢癌組織樣本研究，結(jié)果顯示BRCA1、MLH1等10個基因甲基化高表達(dá)，基因組合后的靈敏度和特異度分別為69%和70%，對于早期卵巢癌的診斷價值尚不清楚[28]。在臨床工作中，考慮到獲取卵巢腫瘤樣本的難度，目前在血液樣本篩查卵巢癌相關(guān)ctDNA甲基化基因取得了可喜的進(jìn)展：Melnikov等[28]的5基因(BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1)研究，Zhang等[29]的7基因(APC、RASSF1A、CDH1、RUNX3、TFPI2、SFRP5、OPCML)研究，顯示卵巢癌ctDNA甲基化檢測的靈敏度均在85%以上，特異度在60%圖片90%。現(xiàn)存的主要問題一是缺乏早篩特異的單個標(biāo)志物，二是cfDNA含量較低，影響檢測的穩(wěn)定性和靈敏度[30]�；�于基因組甲基化產(chǎn)生的甲基化單倍型區(qū)塊(methylation haplo-type block, MHB)技術(shù)方興未艾，具有早篩和組織溯源的特點(diǎn)，有望使cfDNA甲基化檢測的靈敏度大大提升[31]。

3.3.3 宮頸癌甲基化基因檢測

宮頸癌DNA甲基化基因是婦科腫瘤研究最成熟的生物標(biāo)志物，目前應(yīng)用最多的基因包括POU4F3、PAX1、JAM3、C13ORF18、TERT、ANKRD18CP、CDH6、GFRA1、ASTN1、DLX1、ITG4、RXFP3、SOX17、ZNF671、LHX8、PCDHA4、PCDHA13、SOX1和ZNF582，以及多基因組合的PAX1/JAM3、FAM19A4/miR124-2、CADM1/MAL/miR124-2、與體基因聯(lián)合人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)甲基化的EPB41L3+HPV(HPV16L1、HPV16L2、HPV18L2、HPV31L1和HPV33L2)等，在宮頸刮取細(xì)胞檢測皆有80%以上準(zhǔn)確性[32-33]。雙基因可達(dá)到更佳臨床結(jié)果與成本控制等轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)，更多的基因由于臨床判讀復(fù)雜性與通路信號重迭等因素，其臨床效果需更多證據(jù)；在HPV相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAX1/ZNF582聯(lián)合HPV16/18檢測可將陰道鏡檢查的患者數(shù)量減少31.3%，從而在陰道鏡檢查不易獲得的地區(qū)提供可行的隨訪解決方案[34-35]。此外，連接黏附分子3(JAM3)通過細(xì)胞間的黏附及相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長，能夠顯著提高特異度和陽性預(yù)測值，在臨床中驗(yàn)證EPB41L3/JAM3甲基化與高危型HPV(hrHPV)檢測具有相似的陽性預(yù)測值(分別為0.930和0.954，P=0.395)并顯著高于單獨(dú)的細(xì)胞學(xué)檢查，其可用于與HPV聯(lián)合篩查或分流HPV陽性患者[36]。PAX1/ZNF582與PAX1/JAM3甲基化與HPV16/18聯(lián)合檢測可作為進(jìn)一步陰道鏡檢查的參考，提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確性并避免反復(fù)陰道鏡檢查與婦女罹癌恐慌。例如，對于hrHPV陽性患者，如果甲基化陰性，可以隨訪暫時不做陰道鏡活檢，反之要及時行病理學(xué)檢查明確瘤變的存在。概括甲基化檢測在宮頸病變的臨床應(yīng)用主要是[34-39]：(1) hrHPV陽性患者進(jìn)一步檢查的分流；(2) 對ASC-US/鱗狀上皮低級別病變(low-grade squamous intraepithelia, LSIL)細(xì)胞學(xué)檢查的患者進(jìn)行CIN3陽性分流；(3) hrHPV陽性育齡婦女的管理；(4) 停經(jīng)后婦女篩查避免宮頸萎縮的漏診管理；(5) 退出篩查計(jì)劃女性的退出測試等。DNA甲基化對于檢出HSIL陽性有潛在作用，與HPV檢測的內(nèi)容不同，聯(lián)合檢測可以提高液基細(xì)胞學(xué)診斷的水平，對宮頸瘤變和宮頸癌的精準(zhǔn)診斷具有重要的臨床意義。

4、展望

在過去的十余年中，基于DNA甲基化的生物標(biāo)志物在臨床的開發(fā)和應(yīng)用取得了長足的進(jìn)步，在早期診斷、預(yù)后評估和療效監(jiān)測等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。DNA甲基化協(xié)助肺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤的診斷已經(jīng)用于臨床；肝癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等亦在臨床驗(yàn)證階段，作為一種腫瘤無創(chuàng)診斷的新方法受到歡迎。盡管如此，在DNA甲基化的研究和臨床轉(zhuǎn)化、尤其是在婦科腫瘤方面需要進(jìn)一步加強(qiáng)。針對存在的問題和不足，未來研究的重點(diǎn)是：具有腫瘤組織特異性的DNA甲基化基因的篩選，多甲基化基因的組合檢測和提高檢測的靈敏度，微創(chuàng)樣本和血液ctDNA甲基化檢測的開發(fā)使用，臨床與病理多學(xué)科參與的甲基化檢測臨床轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等。血漿ctDNA甲基化單倍型分型技術(shù)方興未艾，是一種用于腫瘤早篩和組織溯源、連續(xù)監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和多器官轉(zhuǎn)移的有效技術(shù)。毋庸置疑，DNA甲基化檢測將在助力腫瘤的精準(zhǔn)診斷和個體化治療上發(fā)揮越來越大的作用。

參考文獻(xiàn)略

引用本文：蔣銘華,易祥華.DNA甲基化檢測助力婦科腫瘤精準(zhǔn)診斷[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2022,43(6):757-762.

作者：蔣銘華1， 易祥華2

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院，上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科

2. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科