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C反應(yīng)蛋白的參考物質(zhì)

ERM-DA472和ERM-DA474

一、建立ERM-DA470（CRM-470）參考物質(zhì)

1993年，歐洲共同體參考局（European Community Bureau of Reference ，BCR）發(fā)布的參考物質(zhì)CRM-470，是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測各種血清（或血漿）蛋白（曾被稱為特種蛋白）國際認(rèn)可的參考物質(zhì)。由于從設(shè)計(jì)、制備、和定值各個(gè)環(huán)節(jié)，都給與充分的研究和保證，這個(gè)參考物質(zhì)從發(fā)布起，立即得到了全世界臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛認(rèn)可。從此，全世界的體外診斷廠商的各種蛋白的檢測系統(tǒng)，凡是在CRM-470參考物質(zhì)中被確認(rèn)的，均以CRM-470為準(zhǔn)，校準(zhǔn)它們的校準(zhǔn)品定值。使全世界臨床實(shí)驗(yàn)室對病人血清（或血漿）的這些蛋白檢測結(jié)果，逐漸實(shí)現(xiàn)了良好的可比性�；�本上滿足了臨床對病人疾病診斷和監(jiān)視的要求。

二、2008年出現(xiàn)了ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC

從2008年起，歐共體參考局將發(fā)布的參考物質(zhì)重新命名為ERM（European Reference Material），強(qiáng)調(diào)是歐洲的參考物質(zhì)。因此，原CRM470的參考物質(zhì)，被更名為ERM470。并且完全按照參考局對所有參考物質(zhì)分類編排，臨床實(shí)驗(yàn)室專用的參考物質(zhì)為DA類；而且非常強(qiáng)調(diào)，這個(gè)參考物質(zhì)一直是在國際臨床化學(xué)協(xié)會（IFCC）支持和配合下完成的，因此更改后的這個(gè)CRM 470的全稱改為ERM-DA470/IFCC。

2008年，該參考物質(zhì)即將用完，因此需要再制備一批。承擔(dān)研究制備這個(gè)參考物質(zhì)的是比利時(shí)海爾市（Geel）歐共體聯(lián)合研究中心，參考物質(zhì)和測量研究院（IRMM）。該中心的I.Zegers負(fù)責(zé)這項(xiàng)任務(wù)。工作組完全按照原ERM-DA470的制備方案，制備新一批的參考物質(zhì)。制備完成的制品依然被稱為ERM-DA470。

該參考物質(zhì)也完全按照原先方案，將血清分裝后進(jìn)行冷凍干燥處理。

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，新一批的ERM-DA470內(nèi)C-反應(yīng)蛋白的實(shí)際含量，只是分裝前液體物質(zhì)內(nèi)具有的CRP的約80%。出現(xiàn)了明顯減少的偏移。

為此，經(jīng)研究決定，將冷凍干燥的這個(gè)參考物質(zhì)命名為ERM-DA470k/IFCC。對其中12個(gè)蛋白進(jìn)行了定值。取代ERM-DA470。C-反應(yīng)蛋白沒有包括在這個(gè)參考物質(zhì)內(nèi)。

為了提供一個(gè)對CRP以后使用具有最佳條件的參考物質(zhì)，將制備ERM-DA470k/IFCC的原液體物質(zhì)（冷凍干燥前的液體血清），分裝安瓿后封口后置深低溫冰凍保存于-70℃，成為專門為CRP檢測使用的參考物質(zhì)，命名為ERM-DA472/IFCC。

ERM-DA472/IFCC使用了ERM-DA470參考物質(zhì)為校準(zhǔn)物為CRP定值。使用了目前認(rèn)為是參考程序的值轉(zhuǎn)移方案予以實(shí)現(xiàn)。用于測量（檢測）CRP濃度的原理為免疫散射和免疫透射。在不同的儀器/試劑組合下（Abbott Architect、Beckman Immage、BN Ⅱ、不同的Hitachi儀器、和Olympus AU 640）進(jìn)行測量。有8個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了定值。被確認(rèn)的CRP質(zhì)量濃度為41.8 mg/L，擴(kuò)展的不確定度（k=2）為2.5 mg/L。

三、冷凍干燥造成CRP回收問題的表現(xiàn)和原因

造成ERM-DA470k/IFCC經(jīng)冷凍干燥后，內(nèi)含的CRP檢測結(jié)果回收不佳（見圖1）。

圖1、irmm檢測經(jīng)冷凍干燥和液體血清內(nèi)crp的回收表現(xiàn)。

經(jīng)研究確定是CRP在冷凍干燥過程中，是內(nèi)含CRP產(chǎn)生了解離。原先具有生物活性的人CRP，在血漿中呈一個(gè)五聚體結(jié)構(gòu)。（圖2）

圖2、在人血漿中天然CRP為五聚體蛋白。由五個(gè)相同的單體組合。每個(gè)單體的分子量約為25105 Da。五聚體內(nèi)結(jié)合了2個(gè)Ca++。

1、CRP的不同低聚物形式對檢測結(jié)果的影響：

臨床檢驗(yàn)的免疫檢測，檢測的是目標(biāo)蛋白與對應(yīng)抗體間形成的凝聚物（是凝聚物使分析儀上入射光的散射或透射光強(qiáng)度變化，產(chǎn)生了檢測信號的變化）。

該圖以三聚體代表CRP的五聚體形式。蛋白與檢測抗體相遇結(jié)合，開始形成增大的聚合物。

在反應(yīng)物中，抗原抗體凝聚物繼續(xù)發(fā)展，產(chǎn)生更大的凝聚物成為可檢測信號。樣品內(nèi)的分析物含量被檢測了。

但是，經(jīng)諸如冷凍干燥處理中，使原先的蛋白分子被解離，加入的抗體與解離的抗原分子難以形成聚合物，產(chǎn)生不了可檢測信號！

因此，從校準(zhǔn)開始因低聚物狀態(tài)而變化，嚴(yán)重影響了檢測過程！最后變得無法檢測。

上述解釋也許是當(dāng)前對采用抗原抗體反應(yīng)，經(jīng)冷凍干燥處理后產(chǎn)生嚴(yán)重后果的較好解釋。

2、為什么ERM-DA470/IFCC沒有報(bào)告冷凍干燥對CRP檢測結(jié)果的影響？

很長時(shí)間里我也有想法，為什么第一批ERM-DA470/IFCC，也經(jīng)歷了冷凍干燥處理。應(yīng)該也發(fā)生了上述的變化。但為什么沒有報(bào)告反映，冷凍干燥對檢測結(jié)果的影響進(jìn)行分析研究？當(dāng)時(shí)的CRM470研究中，應(yīng)該也檢測了回收率，怎么沒有出現(xiàn)如ERM-DA470k/IFCC內(nèi)，如此不佳的回收表現(xiàn)？

我再次查閱原CRM-470的資料，認(rèn)真查對。發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)在制備CRM-470 時(shí)，沒有對用于制備參考物質(zhì)的原始混合血清內(nèi)含有的CRP，進(jìn)行過檢測！將外加的CRP混到血清中，也沒有檢測冷凍干燥前CRP的含量！只關(guān)注了冷凍干燥后經(jīng)復(fù)溶液內(nèi)被所有參與定值實(shí)驗(yàn)室，檢測結(jié)果的一致性！這個(gè)漏洞大家都被疏忽了！

感謝IRMM參與制備ERM-DA470/IFCC的團(tuán)隊(duì)！他們確實(shí)非常認(rèn)真地檢查了整個(gè)制備全過程的內(nèi)容！

如果，2008年的整個(gè)制備過程記錄，也像1993年那樣，忽略記錄參考物質(zhì)內(nèi)含有的CRP含量的變化，那么也不會出現(xiàn)今天的ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC兩個(gè)參考物質(zhì)了！感謝IRMM的團(tuán)隊(duì)！