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實時定量PCR也被稱為實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一種在DNA擴增反應中加入熒光基團，以熒光信號積累實時監(jiān)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量，進而對待測樣品中的目的序列進行定量分析的方法。

基本原理

在學習實時定量PCR數(shù)據(jù)處理之前，我們首先需要了解一下它的數(shù)學原理，Ct值為什么是我們數(shù)據(jù)處理過程中的一個關鍵的因素。這兩個圖顯示的是實時定量PCR的一組結果。上圖是原始的線性圖譜，下圖則是處理過的指數(shù)圖譜，但是它們兩者表示的是同樣的意思。x-軸表示PCR 循環(huán)數(shù)，y-軸表示擴增反應的熒光值，也就是擴增產(chǎn)物的量。這個圖中有基線、閾值、Ct值這幾個概念，從這幾個值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

（1）那么什么是基線？如紅色框所指，基線就是擴增曲線中的水平部分。在反應最初階段，雖然產(chǎn)物是指數(shù)級增長，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。因此基線信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當累積了足夠的擴增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個信號的值就被稱為閾值，如紅色箭頭所指。通常閾值默認為基線信號的標準偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應仍然是指數(shù)級增長的，因此此時的PCR結果可靠，可以準確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強度達到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)，也就是擴增曲線與閾值的交叉點，如圖中的紅點所指。

（2）我們可以看到圖的右邊顯示了擴增曲線的4個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。其中在基線期和指數(shù)增長期，擴增產(chǎn)物都是以指數(shù)級增長的，但是在基線期我們沒有辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數(shù)增長期的Ct值就成為了計算模板含量的一個關鍵值。

（3）那么，為什么知道了Ct值就能夠得到最初的目的基因含量呢？圖中表示一個基因的單次反應擴增曲線。上面這個公式計算的是擴增產(chǎn)物的分子數(shù)N，它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說，如果擴增效率為100%，產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是綠色框的部分。

數(shù)據(jù)處理

1、這里的三張圖片分別展示了我們在做熒光定量PCR時提到的三個名稱：擴增曲線，標準曲線，熔解曲線。

（1）擴增曲線：擴增曲線有兩種展現(xiàn)形式，一種是線性，一種是對數(shù)形式。我們通常是用CT 來推算樣品中樣品的濃度。CT 值越高說明模板濃度越低。上面也詳細說明了原理，在這里就不過多贅述。

（2）標準曲線：將已知濃度的樣品（標準品）經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進行熒光定量PCR，得到的一系列的Ct值，用這個Ct值與Log模板數(shù)對應可以得到一個相關的曲線，我們叫標準曲線�？梢杂眠@個標準曲線中的一些參數(shù)來判斷這個熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。

（3）熔解曲線：Tm值，Melting Temperature（解鏈溫度），PCR雙鏈產(chǎn)物的退火溫度。這兩個圖是在熒光定量PCR結束后，對產(chǎn)物進行逐步升溫時進行的監(jiān)測，可以看到在達到其解鏈溫度時，熒光信號會有一個忽然的下降。我們將測得的這個曲線叫做熔解曲線。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個Tm值，在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰，那么可以判斷產(chǎn)物不是單一的，發(fā)生了非特異擴增。

2、絕對定量：用于確定未知樣本中某個核酸序列的絕對量值，即通常所說的拷貝數(shù)。絕對定量需要已知濃度的模板來建立標準曲線。絕對定量在我們的實驗中不常用，所以只簡單介紹一下。是通過樣品的CT 值和標準曲線進行比較實現(xiàn)的。分析的結果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細胞，每微克總RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。

3、相對定量：是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異或是目標轉錄本在不同時相的表達差異，也就是倍數(shù)差異。

以上圖為例，分析結果是在試驗組和對照組中某一個靶基因的相對比率，即倍數(shù)差異。

進行相對定量可以以質量單位或者是參照基因作為標準，但是以參照基因作為標準的做法更加普遍，也更加方便，因此只介紹后者。用參照基因的優(yōu)點是，這個方法能準確量化模板中的靶基因含量，尤其是當模板難以獲得時，進行相對基因表達分析實驗十分方便。但前提是我們必須要找到在不同狀態(tài)中恒定表達的基因，而且它的表達水平不受樣品處理方式的影響，比如熱刺激，菌誘導等。