小分子背景簡介
小分子即小分子化合物，是指分子量通常低于1000道爾頓、結(jié)構(gòu)簡單的化合物。我們常見的小分子物質(zhì)包括生理激素、農(nóng)獸藥殘留、生物毒素等。小分子檢測在臨床醫(yī)學診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制等領(lǐng)域具有重大意義，尤其是在醫(yī)學診斷領(lǐng)域，隨著小分子研究的深入，其臨床應用也越來越廣泛。
臨床應用方面常見的小分子有很多，如T3、T4、雌二醇、孕酮、醛固酮、25羥基維生素D、他克莫司、環(huán)孢霉素等。
臨床上常見的小分子化合物
然而，由于小分子本身結(jié)構(gòu)的特點，其分子體積和空間位阻受限；且小分子物質(zhì)通常也只有一個抗原表位，僅有反應原性，沒有免疫原性，很難產(chǎn)生免疫應答，只有通過與大分子蛋白或者載體蛋白結(jié)合，形成“完全抗原”，才能具有免疫原性，產(chǎn)生特異性識別小分子抗原的抗體。
小分子常見檢測方法分析
小分子化合物在醫(yī)學檢驗中得到應用的方法主要包括LC-MS/MS和化學發(fā)光免疫分析方法。
LC-MS/MS檢測方法
LC-MS/MS檢測方法歷來是小分子物質(zhì)檢測的金標準，該方法通過小分子物質(zhì)的質(zhì)荷比進行精確定量，具有較高的準確性和特異性。
LC-MS/MS方法一般包括樣本前處理、液相色譜的分離和質(zhì)譜檢測。在整個流程中，前處理環(huán)節(jié)是整個分析過程中最關(guān)鍵且耗時最長的步驟，包括溶液制備、樣本準備、樣本提取、蛋白沉淀、離心、濃縮和復溶等步驟。
尤其針對血液樣本這類包含有各種蛋白質(zhì)、鹽離子等與目標分析物無關(guān)的物質(zhì)的復雜標本，LC-MS/MS的前處理更為繁瑣，而且不同分析物的處理方式不同，具有分析物依賴的特殊性。比如25(OH)D在前處理過程中需要額外進行堿化分離結(jié)合蛋白；雌二醇樣本在進入LC-MS/MS分析前還需要進行額外的丹磺酰氯衍生化增強離子化效率等。因而，前處理的質(zhì)量很大程度決定了后續(xù)質(zhì)譜檢測的準確性。
目前來看，LC-MS/MS方法現(xiàn)階段很難在醫(yī)學檢驗端普及開來。因為不僅需要較昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，樣品常常還需要進行特殊處理，同時還存在有機溶劑接觸風險、耗時費力、通量小等局限性。
化學發(fā)光免疫競爭法
在化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，由于小分子物質(zhì)分子質(zhì)量小，僅有單一抗原決定簇，無法提供2個及以上的表位與抗體結(jié)合，因此傳統(tǒng)的夾心法不能用于小分子物質(zhì)的檢測，現(xiàn)階段主流廠家均采用免疫競爭法檢測小分子物質(zhì)。
在競爭法反應體系中，由于包被的抗體量以及標記的抗原量都是有限的，不利于抗原抗體的溫育，檢測范圍和靈敏度受限；同時，競爭法采用單株抗體，也更容易受到交叉干擾影響。
競爭法通常會采用標記抗原衍生物的方式進行競爭檢測，但是抗原衍生物制備過程中可能會出現(xiàn)抗原表位部分或者全部被標記物占據(jù)的情況，從而導致抗原衍生物對抗體的親和力降低。而且，抗原衍生物和分析物抗原本身結(jié)構(gòu)會存在微小的差異，對同一株抗體的親和力往往很難保持一致，導致競爭過程的不平衡。另外，競爭法中分析物濃度與反應信號值呈負相關(guān)，在低濃度區(qū)段反應信號很難與零區(qū)別開來，低值區(qū)域的相對誤差較大。
所以化學發(fā)光免疫競爭法在檢測小分子化合物時，很難與LC-MS/MS檢測結(jié)果有良好的一致性。前期大量的研究顯示，對于小分子25羥基維生素D和醛固酮，化學發(fā)光免疫競爭法與質(zhì)譜檢測結(jié)果之間一致性較差。
25羥基維生素D主流競爭法廠家與質(zhì)譜檢測結(jié)果比對
醛固酮主流競爭法廠家與質(zhì)譜檢測結(jié)果比對
綜上，化學發(fā)光免疫競爭法檢測小分子物質(zhì)在靈敏度、特異性、準確性等分析性能方面還是存在諸多的局限性，也進一步限制了在臨床上的廣泛使用。
小分子檢測在臨床應用層面的困境
目前，市場上常見的小分子檢測產(chǎn)品主要包括25羥基維生素D、醛固酮、雌二醇、睪酮等。同時受限于目前的檢測技術(shù)水平，多數(shù)小分子物質(zhì)的臨床應用價值還有待于進一步深入挖掘和分析。
25(OH)D檢測
25羥基維生素D（25(OH)D）的檢測主要用于判斷個體內(nèi)維生素D的營養(yǎng)狀況，準確測定需要能夠同時檢出25(OH)D2和25(OH)D3。
美國疾控中心（CDC）統(tǒng)計了參與維生素D標準化項目（VDSP）的所有廠家的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，不同廠家檢測結(jié)果與LC-MS/MS之間的一致性堪憂，維生素D免疫學檢測的標準化建設(shè)任重道遠。
維生素D標準化項目各廠家與參考方法比對
同時，當患者服用維生素D2的補劑或者藥物，樣本中含有不同濃度的25(OH)D2時，相關(guān)性欠缺，整體偏差較大，說明目前的免疫競爭法還難以準確定量檢測25(OH)D2。
各免疫學方法在不同含量25OHVD2時與質(zhì)譜方法比較
研究報道，25(OH)D在檢測過程中容易受到3-epi-25(OH)D3同分異構(gòu)體的交叉干擾影響，同時血液中存在的大量的維生素D結(jié)合蛋白也會對免疫學檢測造成影響，在目前25(OH)D質(zhì)譜檢測已經(jīng)具有較好的準確性的同時，免疫學檢測還有很長的路要走。
維生素D結(jié)合蛋白對免疫學方法檢測25羥基維生素D的影響
醛固酮檢測
醛固酮檢測主要用于原發(fā)性醛固酮增多癥的篩查和確診，已有研究報道，免疫學檢測醛固酮和LC-MS/MS之間存在一致性和相關(guān)性欠缺的問題，尤其是小于100pg/mL的低濃度區(qū)段，免疫學檢測結(jié)果普遍偏高。
另外，免疫學檢測醛固酮并未實現(xiàn)標準化，因此各廠家之間的結(jié)果可比性也較差。2022年衛(wèi)健委發(fā)布的醛固酮能力驗證報告顯示，化學發(fā)光法檢測醛固酮相較于質(zhì)譜靶值存在較大偏倚，尤其是低濃度樣本，個別組偏倚甚至高達114.3%。
醛固酮低值區(qū)域免疫競爭法和質(zhì)譜檢測比對
有研究者提出，由于抗體特異性不足，部分免疫分析法檢測的醛固酮含量實際為醛固酮與其代謝產(chǎn)物醛固酮3C葡萄糖苷酸等含量之和，從而造成測試結(jié)果的偏高。而臨床上根據(jù)目前應用的場景和積累的臨床證據(jù)，針對醛固酮單獨設(shè)定截斷值，并從以往的100pg/ml以上下調(diào)至100pg/ml以下，這對于現(xiàn)階段的競爭免疫分析方法提出了巨大的挑戰(zhàn)。
雌二醇檢測
雌二醇的檢測通常用于生長發(fā)育、輔助生殖監(jiān)測等方面，這一類人群雌二醇的濃度水平都較高，對靈敏度要求并不高。但是研究發(fā)現(xiàn)，小于20pg/mL的低濃度雌二醇的應用場景也非常廣泛，然而免疫學的檢測還不夠靈敏。多項研究表明，在男性、青春期前的兒童以及絕經(jīng)后女性這類雌二醇濃度較低的人群中，采用免疫學檢測雌二醇和LC-MS/MS方法之間高度不一致，相關(guān)系數(shù)普遍較低。
同時，雌二醇常用于服用氟維司群的乳腺癌患者的治療監(jiān)測，研究發(fā)現(xiàn)，氟維司群會引起交叉反應，導致雌二醇測試結(jié)果偏高，因此，現(xiàn)階段的競爭法極大的限制了雌二醇檢測在生理濃度較低的人群中臨床價值的探索。
睪酮檢測
睪酮檢測可以用于前列腺癌的臨床管理。前列腺癌具有雄激素依賴特征，我國轉(zhuǎn)移性前列腺癌占新發(fā)病例的54%，而雄激素剝奪治療是目前主要的治療手段。
多年前國際公認的去勢水平是睪酮低于50ng/dL（1.735nmol/L），受限于當時的檢測技術(shù)水平，現(xiàn)有的方法證實手術(shù)去勢后睪酮的平均水平是15ng/dL，因此睪酮＜20ng/dL（0.694nmol/L）應該是比較合理的去勢水平。治療期間睪酮下降到更低水平（深度降酮）與更佳的疾病預后和轉(zhuǎn)歸相關(guān)。
睪酮管理貫穿前列腺癌診斷、評估、治療及預后評價多個過程，對于不同疾病階段的患者均具有重要臨床意義，現(xiàn)階段市場主流免疫競爭法試劑的靈敏度還存在一定的局限性。高靈敏睪酮檢測如何應用于前列腺癌的治療監(jiān)測還有待于進一步探索。
小分子LC-MS/MS檢測方法現(xiàn)階段存在較多的局限性，如樣本前處理難以標準化和統(tǒng)一，尤其是臨床血液樣本處理難度大、耗時，導致在醫(yī)學檢驗端使用受限。
對于化學發(fā)光免疫競爭法來說，雖然具有操作簡便、檢測通量高等優(yōu)勢；但由于采用單株抗體、定量抗體環(huán)境中進行競爭反應，存在與金標準質(zhì)譜檢測結(jié)果一致性差，特異性不高以及檢測靈敏度差等問題。
醫(yī)學檢驗服務(wù)臨床診斷，作為醫(yī)生的眼睛。每當困境出現(xiàn)的時候，就是技術(shù)創(chuàng)新驅(qū)動力誕生的時候，她將推動技術(shù)以及技術(shù)背后材料發(fā)生革命性突破。
在下期中，我們將一同探討小分子化合物檢測技術(shù)的發(fā)展，是否能找到一種兼顧LC-MS/MS檢測方法和化學發(fā)光免疫分析法兩種技術(shù)優(yōu)勢的方法！操作類似化學發(fā)光檢測技術(shù)一樣簡便，一管血離心后直接上機檢測；準確度可比肩金標準LC-MS/MS檢測方法。
【參考文獻】
[1]王亞輝, 李彥伸, 宋麗廷, 等. 小分子化合物非競爭免疫檢測方法研究概述[J]. 食品與生物技術(shù)學報, 2017, 36(2): 113-121.
[2]Piran U, Riordan W J, Livshin L A. New noncompetitive immunoassays of small analytes[J]. Clinical chemistry, 1995, 41(7): 986-990.
[3]Chen F, Cheng Z, Peng Y, et al. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based assay for simultaneous quantification of aldosterone, renin activity, and angiotensin II in human plasma[J]. Journal of Chromatography B, 2021, 1179: 122740.
[4]Wise S A, Camara J E, Sempos C T, et al. Vitamin D Standardization Program (VDSP) intralaboratory study for the assessment of 25-hydroxyvitamin D assay variability and bias[J]. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2021, 212: 105917.
[5]Tolan N V, Yoon E J, Brady A R, et al. Price of high-throughput 25-hydroxyvitamin D immunoassays: Frequency of inaccurate results[J]. The Journal of Applied Laboratory Medicine, 2018, 2(6): 868-879.
[6]周偉燕,張傳寶,馬文君,蔡軍,陳文祥.加強我國醛固酮標準化和腎素一致化建設(shè)[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2020,43(3):245-249.
[7]Wise S A, Camara J E, Burdette C Q, et al. Interlaboratory comparison of 25-hydroxyvitamin D assays: Vitamin D Standardization Program (VDSP) Intercomparison Study 2—Part 1 liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) assays—impact of 3-epi-25-hydroxyvitamin D3 on assay performance[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2022, 414(1): 333-349.
[8]Heijboer AC, Blankenstein MA, Kema IP, Buijs MM. Accuracy of 6 routine 25-hydroxyvitamin D assays: influence of vitamin D binding protein concentration. Clin Chem. 2012 Mar;58(3):543-8.
[9]Blocki F, Zierold C, Olson G, Seeman J, Cummings S, Bonelli F. In defense of aldosterone measurement by immunoassay: a broader perspective. Clin Chem Lab Med. 2017 Mar 1;55(4):e87-e89.
[10]Owen L J, Monaghan P J, Armstrong A, et al. Oestradiol measurement during fulvestrant treatment for breast cancer[J]. British Journal of Cancer, 2019, 120(4): 404-406.
[11]禹松林,方慧玲,程歆琦,張瑞蘋,韓建華,秦緒珍,夏良裕,蘇薇,程倩,邱玲.五種自動化免疫學方法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法測定25羥維生素D的比較[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2015,38(7):475-479.
[12]Rosner W, Hankinson S E, Sluss P M, et al. Challenges to the measurement of estradiol: an endocrine society position statement[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2013, 98(4): 1376-1387.
[13]Naruse M, Katabami T, Shibata H, et al. Japan Endocrine Society clinical practice guideline for the diagnosis and management of primary aldosteronism 2021[J]. Endocrine Journal, 2022, 69(4): 327-359.
[14]國家衛(wèi)生健康委員會，前列腺癌診療指南. （2022年版）.
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