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3、蛋白質(zhì)檢測(cè)的發(fā)展

蛋白質(zhì)方法學(xué)隨時(shí)間在發(fā)展，為了不同的目的應(yīng)用了不同的方法。

在測(cè)定總的血清蛋白濃度上，臨床上開(kāi)始是檢測(cè)蛋白質(zhì)中氮的含量，再來(lái)推算蛋白質(zhì)含量（在國(guó)內(nèi)稱(chēng)為蛋白氮）。這就是Kjeldahl的檢測(cè)氮的改良方法（凱氏定氮）。這個(gè)方法也許至今還依然使用在生物制品確定蛋白質(zhì)含量。

1921年美國(guó)人Howe 敘述了使用硫酸鈉溶液分離血漿蛋白為纖維蛋白原、優(yōu)球蛋白（auglobulin）、和假球蛋白（pseudoglobulin）。依據(jù)較早時(shí)期的研究，優(yōu)球蛋白被確定為實(shí)際上不溶于水、溶解在稀釋的鹽溶液（沉淀在蒸餾水中的球蛋白），但在28%~36%的飽和硫酸銨溶液中被沉淀。1937年，Campbell和Hanna引入亞硫酸鈉對(duì)血液蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。成為臨床實(shí)驗(yàn)室使用的鹽析經(jīng)典方法，從血清中將球蛋白分離，余下的為白蛋白。在使用如雙縮脲方法（或酚試劑）分別定量球蛋白和白蛋白，確定了白蛋白/球蛋白的比率（A/G）。

Tiselius在1937年敘述了在U-管中以電泳的移動(dòng)界面分離蛋白。存在的濃度梯度可以折射儀檢出。直至1948年開(kāi)始普遍使用紙電泳進(jìn)行蛋白分離。

1928年Theodor Svedberg引入分析超離心，開(kāi)始以斯韋德貝里（Svedberg）常數(shù)（S）表示蛋白質(zhì)的特性。據(jù)此按照蛋白質(zhì)的分子量分類(lèi)為4S（~65 kDa）、7S（~150 kDa）、和19S （~900 kDa）分子。γ-球蛋白組分，按照它的電泳泳動(dòng)能力確定，被超離心分為7S和19S組分，7S組分含有IgG、IgA、和IgD；19S組分含有IgM。

不同的非特異方法對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)，可參見(jiàn)表2。

許多疾病的診斷要求更多的某些蛋白的精確濃度信息，各個(gè)人體蛋白在血漿、血清、腦脊液、和尿液中的定量檢測(cè)是診斷和監(jiān)視疾病與治療有效性上的重要工具。在人體液的復(fù)雜基質(zhì)中特定蛋白的定量，以特定抗體可最有效地實(shí)現(xiàn)。在20世紀(jì)中期，開(kāi)始制備和使用抗體作為分析工具。這是在Michael Heidelberger和Forrest Kendall在1935年報(bào)告了沉淀反應(yīng)的定量研究，以及RL.Libby于1938年研究了散射的免疫沉淀后。雙價(jià)抗體和單價(jià)蛋白間的結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致許多抗體和蛋白質(zhì)分子形成了聚集體。（圖3）

圖3 蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)聚集示意圖

但是一個(gè)蛋白的抗原決定簇單價(jià)特性，可因蛋白質(zhì)的重復(fù)結(jié)構(gòu)，特別在多聚體蛋白內(nèi)或因在一個(gè)多克隆抗血清內(nèi)抗體的不同決定簇的特異性，產(chǎn)生了蛋白質(zhì)抗原與抗體聚集不同表現(xiàn)。無(wú)形中，一個(gè)蛋白質(zhì)的很多免疫反應(yīng)決定簇，可以與各個(gè)對(duì)應(yīng)抗體產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)。而一個(gè)蛋白質(zhì)相應(yīng)地，也成為了免疫學(xué)中多價(jià)的可溶性蛋白質(zhì)抗原。

免疫化學(xué)分析中，一個(gè)多價(jià)的可溶性蛋白質(zhì)抗原與它相應(yīng)抗體（Ab）在一個(gè)免疫化學(xué)檢測(cè)中的結(jié)合，是一個(gè)平衡反應(yīng)，發(fā)生在系列的不同步驟，如下所述（b、d、m、x、和y為整數(shù)，且b、d＜m＜x、y）：

1、在起始反應(yīng)中，抗原Ag和抗體Ab快速結(jié)合，形成（AgAb）抗原抗體復(fù)合物；

2、形成免疫復(fù)合物AgAbm，并緩慢地增長(zhǎng)（AgdAbm+b）；

3、在免疫復(fù)合物中，抗原和抗體分子數(shù)增加，一旦達(dá)到臨界大小，最后產(chǎn)生沉淀（AgxAby）。

在反應(yīng)中分子大小實(shí)質(zhì)性的增大，不僅在溶液中產(chǎn)生了沉淀，而且也改變了沉積和擴(kuò)散系數(shù)，以及改變了光散射的行為。

Michael Heidelberger和Forrest Kendall于1935年檢測(cè)了被沉淀的抗體量，第一個(gè)以定量詞語(yǔ)敘述了“免疫沉淀反應(yīng)”。在他們的實(shí)驗(yàn)中，他們將不斷增加的抗原，加到具有相同抗體濃度的系列溶液中。

圖4 在恒定抗體濃度下增加抗原濃度的免疫沉淀反應(yīng)。

在抗原濃度和被沉淀的抗體間關(guān)系的一般形式，參見(jiàn)圖4。經(jīng)常被稱(chēng)為“Heidelberger-Kendall曲線”，可分為三個(gè)不同的區(qū)域：

1、“抗體過(guò)�！笔堑谝粋�(gè)區(qū)域（A），出現(xiàn)較低的Ag/Ab比率，形成少量沉淀；但隨著抗原

濃度增加，發(fā)生越來(lái)越多的沉淀。

2、“平衡區(qū)帶”是第二個(gè)區(qū)域（B），抗原和抗體濃度具有最佳比率。隨著更多抗原與抗體結(jié)合，達(dá)到了最大形成沉淀點(diǎn)。在溶液中，存在很少或沒(méi)有游離抗原或游離抗體。

3、“抗原過(guò)�！笔堑谌齻�(gè)區(qū)域（C），Ag/Ab比率升高。因?yàn)楹芨叩目乖瓭舛�，形成很小的、可溶性的免疫�?fù)合物。與較大的沉淀物相比，Ag2Ab 的整體組成更多。這些小的復(fù)合物沒(méi)有大至從溶液中析出，也無(wú)法被普通的光散射檢測(cè)出來(lái)。

這個(gè)曲線的原理結(jié)構(gòu)展現(xiàn)了，每一個(gè)免疫化學(xué)反應(yīng)中的特性特征。這個(gè)獨(dú)特的曲線表現(xiàn)特別需要注意的是，無(wú)論使用散射免疫比濁還是免疫透射比濁，它們的檢測(cè)信號(hào)指示了一個(gè)相同的信號(hào)讀數(shù)（被抗體沉淀的），有兩個(gè)可能抗原濃度；一個(gè)檢測(cè)是在抗體過(guò)剩區(qū)域，另一個(gè)在抗原過(guò)剩區(qū)域。某個(gè)檢測(cè)方法的抗體濃度水平被設(shè)定在抗體過(guò)剩區(qū)，確保了所有預(yù)期抗原濃度處于抗體過(guò)剩狀態(tài)，這樣的檢測(cè)結(jié)果可靠有效。在凝膠方法的抗原單向擴(kuò)散方法中，抗原向含有抗體的凝膠移動(dòng)，在加樣孔處表現(xiàn)為抗原過(guò)剩，不會(huì)出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物的沉淀�？乖�向外擴(kuò)散到抗原和抗體間比率變化恒定下，實(shí)現(xiàn)抗原抗復(fù)合物達(dá)到最大沉淀，呈直線或環(huán)狀沉淀線。實(shí)驗(yàn)室可以測(cè)量沉淀線的直徑，與標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)果比較，得到樣品中存在的抗原量。

這些內(nèi)容很容易被大家認(rèn)為沒(méi)有什么價(jià)值。確實(shí)，很多內(nèi)容很老了。我只是在整理中看到了以往沒(méi)有認(rèn)識(shí)的內(nèi)容。但是，采用抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生免疫復(fù)合物的方法，至今在蛋白質(zhì)分析中被普遍采納。需要有更多的了解。