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葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一個關鍵酶和限速酶，其主要的功能是產(chǎn)生NADPH。NADPH對于維持細胞的正常生理功能和形態(tài)具有極為重要的作用。當其缺乏時，紅細胞極易受到氧化損傷，出現(xiàn)溶血性疾病，表現(xiàn)為黃疸甚至出現(xiàn)核黃疸。蠶豆病是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者在進食蠶豆或蠶豆制品后所引發(fā)的急性血管內(nèi)溶血性貧血，臨床表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染，有些病例出現(xiàn)血紅蛋白尿，有些則有肝腫大現(xiàn)象。蠶豆病多發(fā)于幼兒及兒童，以男性多見。G6PD基因突變是導致該基因缺乏的主要原因，G6PD基因定位于Xq28，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥屬于X連鎖不完全顯性遺傳，早期的診斷和預防具有重大意義。

一、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶常用檢測方法

目前，G6PD常用檢測方法包括酶學和基因檢測兩大類，酶學檢測法包括葡萄糖-6-磷酸底物法、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase 6PGD)比值法、高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點法等；常規(guī)基因檢測法包括等位基因特異性擴增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探針雜交(ASO)、錯配堿基聚合酶鏈反應/限制性內(nèi)切酶圖譜分析等。

二、目前已批準葡萄糖-6-磷酸脫氫酶產(chǎn)品概況

目前已上市葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測產(chǎn)品包括檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變情況的基因檢測法以及檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶含量及活性的酶學檢測法。樣本類型包括血清、全血、新生兒足跟血濾紙干血片等多種類型。

1.基因檢測方法

已上市基因檢測產(chǎn)品的方法學包括熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法等，用于體外定性檢測人外周血基因組DNA中的中國人群常見的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變。

2.酶學檢測方法

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶活性檢測方法具有操作簡單、方便快捷、價格低廉等諸多優(yōu)點，已在臨床診斷中被廣泛應用。已上市酶學檢測產(chǎn)品的方法學多為葡萄糖-6-磷酸底物法。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在NADP（氧化型輔酶Ⅱ）存在條件下催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH（還原型輔酶Ⅱ）。在340nm處測定NADPH的生成速率，即可檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。此外還有比值法檢測試劑，試劑A液用于檢測G6PD活性，B液用于檢測6PGD活性，兩者分別在不同的通道內(nèi)檢測，采用速率法分別檢測紅細胞中G6PD與6PGD的活性，反應原理均為催化其相應的底物反應，同時將NADP還原為NADPH，通過監(jiān)測340nm處吸光度上升的速率即可計算兩者的活性，再計算兩者的比值，進而判斷G6PD是否缺乏。

三、國際葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑監(jiān)管概況

WHO于2016年10月發(fā)布了《葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測體外診斷試劑指導原則》，該指南根據(jù)性別和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性將人群劃分為正常、缺陷和中介（如表1）�，F(xiàn)將該指南對分析性能評估的要求概述如下。

表1  葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性劃分

1.適用樣本類型

（1）證明樣本類型的等效性

至少選用25個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本，證明每種聲稱樣本類型的等效性。

（2）證明聲稱抗凝劑的等效性

至少選用25個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本，證明每種聲稱抗凝劑的等效性。

2.樣本收集、儲存和運輸

樣本穩(wěn)定性研究應考慮到儲存條件（不同溫度下的持續(xù)時間、濕度變化、溫度限制、凍融循環(huán)），運輸條件（如適用），樣本采集和/或轉(zhuǎn)移裝置（包括干血斑濾紙）是否含有抗凝劑、是否可以密封。

3.精密度

重復性和再現(xiàn)性試驗都應根據(jù)預期用途選用至少1個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、1個中介樣本和1個缺陷樣本。所選樣本應確保在關鍵決策點附近、具有良好的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性代表性。必須證明關鍵決策點附近樣本的精密度。每個測試樣本應采用三批試劑，進行5個重復，運行3-5次，選擇3個不同的試驗地點，酶學方法還應選用2個溫度。

4.分析靈敏度

（1）最低檢出限

選擇至少8個樣本進行最低檢出限研究，每個濃度至少檢測15次。將95%檢出率的最低酶活性作為最低檢出限。所檢測樣本的酶活性應采用合適的生物學參考物質(zhì)以及合適的參考方法進行校正。

（2）關鍵決策點性能驗證

必須驗證試劑區(qū)分葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的能力（如正常、缺陷、中介）。

可以采用不同比例混合葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常和缺陷樣本來實現(xiàn)，獲得廣泛的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，從而了解決策點（即缺陷/中介/正常）的性能。應測試至少三對單獨試樣的混合物。

（3）測量范圍和相關性

定量檢測試劑必須采用經(jīng)合適生物學參考物質(zhì)以及合適參考方法進行校正的、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性已知的樣本進行測量范圍研究。對已知G6PD活性樣本的平行試驗結果進行適當?shù)慕y(tǒng)計分析，還應確定定量與適當參考試驗的相關性程度。

對于報告血紅蛋白濃度或?qū)⒀�紅蛋白濃度標準化作為報告結果的一部分的試劑，還必須確定測定血紅蛋白濃度的定量測量范圍和相關程度。

5.分析特異性

特異性研究必須研究假正�；蚣偃毕萁Y果的可能性，研究可采用自然或人工樣本進行。內(nèi)源性干擾物質(zhì)包括：總膽固醇，血脂、膽紅素和蛋白質(zhì)升高樣本，乳酸，乳酸脫氫酶，含銅化合物如氯化銅、硫酸銅，異常高值（54-65%）和異常低值（17-18%），血球壓積，網(wǎng)織紅細胞，白細胞和血小板升高樣本，瘧疾，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，肺炎，傷寒，鐮狀細胞貧血，變異血紅蛋白（A、D、E、S、C），貧血，血紅蛋白病，缺鐵，白血病和/或其他紅細胞疾病，糖尿病。外源性干擾物質(zhì)包括相關藥物，如抗寄生蟲、抗瘧疾、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗結核藥物、普通非處方抗炎藥物（阿司匹林、撲熱息痛、布洛芬）、乙醇、咖啡因和某些類固醇（醛固酮相關）。

四、對我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑審評的思考

目前已有相關產(chǎn)品在國內(nèi)上市，部分處于研發(fā)或計劃申報階段。此類產(chǎn)品對人體樣本中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行檢測，臨床上主要用于遺傳性紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的輔助診斷，產(chǎn)品臨床風險較高。企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)過程中對產(chǎn)品的認識程度不一，在參考品設置、分析性能評估等方面存在較多問題，有必要對這些共性問題進行總結規(guī)范，為申報企業(yè)從產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)至注冊申報階段提供更為全面的指導，為技術審評提供參考依據(jù)。

參考文獻：

[1] WHO.In vitro diagnostic medical devices to identify phosphate dehydrogenase Glucose-6-(G6PD) activity.2016.10.

[2] 新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與診斷實驗室檢測技術專家共識.鄒琳中華檢驗醫(yī)學雜志2019年3月第42卷第3期.