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第三代測序技術(shù)是指單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，也叫從頭測序技術(shù)。與前兩代測序技術(shù)相比，其最大的特點(diǎn)就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測序。就當(dāng)前形勢來看，第二代短讀長測序技術(shù)在測序市場上仍然占有絕對(duì)優(yōu)勢，但第三代測序技術(shù)近年來也發(fā)展的如火如荼，且已應(yīng)用于基因組測序、甲基化研究和突變鑒定等多個(gè)研究領(lǐng)域。其中，英國牛津納米孔公司所開發(fā)的納米孔（Nanopore）測序技術(shù)便是三代測序中的中流砥柱。

什么是Nanopore測序？

圖片來源：Oxford Nanopore Technologies官網(wǎng)Nanopore

測序原理：

納米孔測序，顧名思義，核心就是利用一個(gè)納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，再利用動(dòng)力蛋白牽引核酸穿過納米孔。當(dāng)核酸通過納米孔時(shí)使電荷發(fā)生變化，從而引起電阻膜上電流的變化。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時(shí)對(duì)電流產(chǎn)生的干擾不同，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測并解碼這些電流信號(hào)便可確定堿基序列，從而實(shí)現(xiàn)測序。

Nanopore測序中發(fā)揮著重要作用的幾種物質(zhì)：

圖片來源:Oxford Nanopore Technologies官網(wǎng)

Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到細(xì)胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔。經(jīng)過人為基因工程修飾后，得到Nanopore測序所需的Reader蛋白。Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白會(huì)被嵌入到高電阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜兩側(cè)是離子溶液，在兩側(cè)加不同的電位，離子就會(huì)在孔中流動(dòng)，形成電流。Motor——馬達(dá)蛋白，在Nanopore文庫構(gòu)建時(shí)，需要在接頭上連接一種馬達(dá)蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。Tether——用于錨定DNA或RNA鏈，防止其在溶液中飄動(dòng)，并使其進(jìn)入納米孔中。

Nanopore測序的具體流程如何？

Nanopore測序過程：解螺旋，將雙鏈DNA解開成單鏈；DNA單鏈分子通過一個(gè)孔道蛋白，孔道中有個(gè)充當(dāng)轉(zhuǎn)換器的蛋白分子；DNA單分子停留在孔道中，有一些離子通過帶來電流變化，而不同的堿基帶來的電流變化不同；轉(zhuǎn)化器蛋白分子感受5個(gè)堿基的電流變化；根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識(shí)別算法得到堿基序列。

Nanopore測序技術(shù)的優(yōu)勢在哪？

主要優(yōu)勢：

長讀長：Reads可達(dá)Mb；

設(shè)備成本低：測序芯片可清洗再生，重復(fù)利用；

實(shí)時(shí)獲得序列信息：最快可在1小時(shí)內(nèi)完成測序流程及數(shù)據(jù)分析，滿足動(dòng)態(tài)檢測宏基因組需求；

便攜式測序裝置：重量輕且占用空間小，可以隨身攜帶隨時(shí)測序；

直接測序：直接測序原始DNA和RNA，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了擴(kuò)增偏好性；保留了原始?jí)A基修飾信息，能夠直接讀出甲基化的胞嘧啶。

Nanopore測序技術(shù)的應(yīng)用前景如何？

應(yīng)用方向：

#1 大基因組拼接  

在以往基于短片段的基因組拼接中，由于一些動(dòng)植物基因組本身具有多倍體，高度重復(fù)，高度雜合的特性，導(dǎo)致基因組拼接異常艱難。而Nanopore測序技術(shù)具有長讀長的特點(diǎn)，利于大基因組的拼接，可以極大的提高基因組的完整性。 

#2 全長轉(zhuǎn)錄組     

以往的轉(zhuǎn)錄組分析由于無法直接對(duì)RNA進(jìn)行測序，往往需要先對(duì)mRNA進(jìn)行打斷，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，無法獲取和分析全長轉(zhuǎn)錄本。Nanopore的長讀長特點(diǎn)可以準(zhǔn)確識(shí)別各基因的多個(gè)同源異構(gòu)體，簡單準(zhǔn)確；并且可以直接測序RNA，直接識(shí)別RNA的堿基修飾。

#3 大片段結(jié)構(gòu)變異

基因組上會(huì)產(chǎn)生很多與人類疾病相關(guān)的大片段結(jié)構(gòu)變異（如缺失、倒位和易位等），短測序讀長無法準(zhǔn)確檢測這些變異，而Nanopore測序的讀長較長，適合進(jìn)行大片段結(jié)構(gòu)變異的檢測，在疾病研究等方面具有良好的發(fā)展前景。 

#4 微生物快速鑒定 

由于Nanopore測序具有實(shí)時(shí)，快速的特點(diǎn)，可以在采集點(diǎn)直接進(jìn)行測序，實(shí)時(shí)得到序列信息進(jìn)行物種分類鑒定，完成微生物的快速鑒定。